[發(fā)明專利]一種體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202010567358.8
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111662864A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 閻軍;李洋;張怡;劉艷青
• 申請（專利權(quán)）人: 天晴干細(xì)胞股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;C12N5/02;A01N1/02
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 李紅媛

1.一種體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞的方法，其特征在于它按以下步驟實現(xiàn)：

一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)、消化傳代、擴增及凍存；

二、誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞懸球：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過上述消化傳代后懸浮于真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基中，計數(shù)，稀釋到密度為1×10⁵/ml，單細(xì)胞懸液按1.5ml/孔接種在低吸附6孔培養(yǎng)板中，真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入體積百分含量為1‰的10mMY-27632，每2-3天換液一次，培養(yǎng)6天，收集真皮干細(xì)胞細(xì)胞懸球，300rpm離心2min，然后懸浮于真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基，即完成體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞的方法，其特征在于步驟一中所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞取材，進(jìn)行原代培養(yǎng)、消化傳代、擴增及凍存的具體操作如下：

a、新生兒臍帶經(jīng)體積百分含量為75％的酒精消毒處理，然后用生理鹽水清洗2次；

b、將清洗后的臍帶剪成長度為2-3cm的段，在平皿內(nèi)剝離華通式膠；

c、將華通式膠置于離心管內(nèi)，用手術(shù)剪剪碎至1-2mm³的塊狀；

d、按照2g/T75培養(yǎng)瓶接種于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-5天后換液，以后每隔3天換液一次，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70％以上完成原代培養(yǎng)；

e、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞消化傳代和擴增：吸除培養(yǎng)基，PBS洗一次，然后用體積百分濃度為0.25％的胰酶消化4-6min，吹打懸浮，DMEM/F12洗，1000rpm離心3min，再以1×10⁴/cm²密度懸浮于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代和擴增培養(yǎng)；

f、凍存：細(xì)胞懸液加DMSO到10％，混勻，分裝在凍存管中，使用程序降溫盒在-80℃冷凍過夜后轉(zhuǎn)移到液氮罐。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞的方法，其特征在于所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基的成分：95％alphaMEM培養(yǎng)基、添加5％血小板裂解液和5IU/ml肝素鈉。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞的方法，其特征在于步驟二中所述真皮干細(xì)胞培養(yǎng)基的成分：DMEM:F12＝1:1基礎(chǔ)培養(yǎng)基加1/50B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、0.2mM抗壞血酸和2μg/ml慶大霉素。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種體外誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為真皮干細(xì)胞的方法，其特征在于步驟二中培養(yǎng)的條件:37℃，5％CO₂。