[發(fā)明專利]用于檢測(cè)人血液樣本線粒體基因COX I降解程度的特異性引物組合及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010566193.2
• 申請(qǐng)日: 2020-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN111808967B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙東;葉振
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國政法大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

本發(fā)明公開了一種用于檢測(cè)人血液樣本線粒體基因COX I降解程度的特異性引物組合及其應(yīng)用。所述的引物組合由一對(duì)短引物、一對(duì)中引物和一對(duì)長(zhǎng)引物組成，其中，所述的一對(duì)短引物的核苷酸序列如下表SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；所述的一對(duì)中引物的核苷酸序列如下表SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示；所述的一對(duì)長(zhǎng)引物的核苷酸序列如下表SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示。通過計(jì)算長(zhǎng)片段起始拷貝數(shù)與短片段起始拷貝數(shù)以及中片段起始拷貝數(shù)與短片段起始拷貝數(shù)的比值，可以推斷出人線粒體DNA的完整度，進(jìn)而推斷出血液樣本的離體時(shí)間。本發(fā)明首次建立了一種利用線粒體基因COX I檢測(cè)人血液樣本離體時(shí)間的新方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人血液樣本線粒體基因COX I降解程度的特異性引物組合及其應(yīng)用，屬于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。

背景技術(shù)

法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的DNA分型對(duì)案件偵破具有關(guān)鍵作用，因此探討DNA降解規(guī)律是非常有必要的。

自從分子生物學(xué)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域后，通過DNA印記技術(shù)、細(xì)胞分光光度計(jì)法、流式細(xì)胞術(shù)、單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)、計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)研究DNA的降解受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

隨著離體時(shí)間的增加，血液樣本逐漸腐敗變質(zhì)，線粒體DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，雙鏈被打開，線粒體DNA慢慢被分解為單鏈和小片段，線粒體DNA質(zhì)量變化與離體時(shí)間具有相關(guān)性，因此可以從DNA質(zhì)量變化角度推測(cè)人血液樣本的離體時(shí)間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性引物組合進(jìn)而推斷人血液樣本離體時(shí)間的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明從人線粒體DNA質(zhì)量情況推測(cè)人血液樣本離體時(shí)間，為此，本發(fā)明設(shè)計(jì)了三對(duì)引物，一對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為41bp的短引物、一對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為120bp的中引物和一對(duì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為304bp的長(zhǎng)引物。使用三對(duì)不同引物結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增線粒體DNA中的短片段(41bp)、中片段(120bp)和長(zhǎng)片段(304bp)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理是隨著離體時(shí)間增加，線粒體DNA逐漸降解斷裂，其中長(zhǎng)片段更易被降解，中片段次之，短片段相對(duì)更穩(wěn)定，因此可以通過擴(kuò)增長(zhǎng)片段、中片段以及短片段，進(jìn)而計(jì)算出長(zhǎng)片段與短片段以及中片段與短片段起始拷貝數(shù)的比值，推斷出線粒體DNA的完整度，構(gòu)建線粒體DNA完整度與離體時(shí)間的對(duì)應(yīng)曲線，最終推斷人血液樣本的離體時(shí)間。

根據(jù)本發(fā)明，首先，本發(fā)明提出了用于檢測(cè)人血液樣本線粒體基因COX I降解程度的特異性引物組合，所述的引物組合由一對(duì)短引物、一對(duì)中引物和一對(duì)長(zhǎng)引物組成，其中，所述的一對(duì)短引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.2所示；所述的一對(duì)中引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ IDNO.4所示；所述的一對(duì)長(zhǎng)引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ IDNO.6所示。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的特異性引物組合在檢測(cè)人血液樣本離體時(shí)間中的應(yīng)用。

再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種檢測(cè)人血液樣本離體時(shí)間的方法，包括以下步驟：

(1)從人血液樣本中提取DNA；

(2)以人線粒體DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用本發(fā)明中所述的一對(duì)短引物、一對(duì)中引物和一對(duì)長(zhǎng)引物分別進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為縱坐標(biāo)，起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，分別制作對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)以提取的人血液樣本DNA為模板，使用本發(fā)明中所述的一對(duì)短引物、一對(duì)中引物和一對(duì)長(zhǎng)引物分別進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，分別得到相應(yīng)的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，進(jìn)而得到長(zhǎng)片段起始拷貝數(shù)/短片段起始拷貝數(shù)的比值Q304/Q41以及中片段起始拷貝數(shù)/短片段起始拷貝數(shù)的比值Q120/Q41；