[發明專利]用于檢測人血液樣本線粒體基因COX I降解程度的特異性引物組合及其應用

有效

• 申請號: 202010566193.2
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111808967B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 趙東;葉振
• 申請（專利權）人: 中國政法大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.一種特異性引物組合在檢測血液樣本離體時間中的應用，所述引物組合由一對短引物、一對中引物和一對長引物組成，其中，所述的一對短引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的一對中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述的一對長引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ IDNO.6所示。

2.一種檢測血液樣本離體時間的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）從血液樣本中提取DNA；

（2）以人線粒體DNA標準品為模板，使用一對短引物、一對中引物和一對長引物分別進行PCR擴增，以標準品Ct值為縱坐標，起始拷貝數的對數為橫坐標，分別制作對應的標準曲線；

其中，所述的一對短引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述的一對中引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述的一對長引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ IDNO.6所示；

（3）以提取的血液樣本DNA為模板，使用所述的一對短引物、一對中引物和一對長引物分別進行qPCR擴增，分別得到相應的Ct值，根據標準曲線計算擴增產物的起始拷貝數，進而得到長片段起始拷貝數/短片段起始拷貝數的比值Q304/Q41以及中片段起始拷貝數/短片段起始拷貝數的比值Q120/Q41；

（4）判定：根據比值判定人血液樣本線粒體DNA的完整度，即比值越小，則表明血液樣本離體的時間越長。

3.如權利要求2所示的方法，其特征在于，步驟（4）中人血液樣本Q比值與離體時間擬合的數學方程在不同條件下是不同的，在-20℃下Q304/Q41與離體時間、4℃下Q304/Q41與離體時間、4℃下Q120/Q41與離體時間、25℃下Q304/Q41與離體時間、25℃下Q120/Q41與離體時間的線性擬合方程分別是: y=-0.0051x+0.9589、y=-0.0068x+0.9228、y=-0.0042x+0.9248、y=-0.0089x+0.9273、 y=-0.0095x+0.9835，其中x表示離體時間，y表示Q304/Q41或者Q120/Q41。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2）以及步驟（3）中qPCR擴增的體系如下所示：

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（2）以及步驟（3）中qPCR擴增的反應條件如下：

預變性：95℃，3分鐘；變性：95℃，15秒；退火、延伸及數據采集：62℃，45秒；共40個循環。