[發(fā)明專(zhuān)利]一種無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010564730.X
• 申請(qǐng)日: 2020-06-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113817761B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林白雪;周航;張譯文;鐘曉彤;劉潔錚;陶勇
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/70
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/70;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/54;C12N15/60;C12N1/21;C12P13/14;C12P35/06;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書(shū)寧

本發(fā)明公開(kāi)了一種無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。該大腸桿菌底盤(pán)菌的制備方法為：提高宿主菌(大腸桿菌或突變型大腸桿菌)中四氫吡啶二羧酸：N?乙酰轉(zhuǎn)移酶、N?乙酰二氨基庚二酸脫乙酰基酶、N?乙酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、O?乙酰同型絲氨酸硫解酶和同型絲氨酸：O?乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量和/或活性，且降低所述宿主菌中四氫吡啶二羧酸：N?琥珀酰轉(zhuǎn)移酶和同型絲氨酸：O?琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量和/或活性，從而獲得無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌。實(shí)驗(yàn)證明，該大腸桿菌底盤(pán)菌可以減少碳丟失率，提高以中心代謝中間產(chǎn)物(如乙酰輔酶A、丙酮酸、α?酮戊二酸)為前體合成目標(biāo)產(chǎn)品的能力。本發(fā)明具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

三羧酸循環(huán)(TCA?cycle)是大腸桿菌中心碳代謝的重要組成部分。眾多生物基化學(xué)品的生物合成都依賴(lài)于三羧酸循環(huán)中間代謝物α-酮戊二酸。同時(shí)敲除大腸桿菌三羧酸循環(huán)中的α-酮戊二酸脫氫酶基因(sucA)和異檸檬酸裂解酶基因(aceA)，迫使更多α-酮戊二酸流向目的產(chǎn)物合成，是促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)品合成的最佳方式。

大腸桿菌在無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以葡萄糖為唯一碳源進(jìn)行有氧生長(zhǎng)時(shí)，三羧酸循環(huán)承擔(dān)著徹底氧化碳源為細(xì)胞生長(zhǎng)提供能量與還原力的功能，也提供了眾多的細(xì)胞生長(zhǎng)必需的代謝物。如果同時(shí)敲除α-酮戊二酸脫氫酶基因(sucA)和異檸檬酸裂解酶基因(aceA)，或敲除sucA，破壞三羧酸循環(huán)代謝，往往導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)緩慢，特別是在無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以葡萄糖為唯一碳源的有氧生長(zhǎng)受到限制。目前，解決的主要策略有兩種：一是對(duì)α-酮戊二酸脫氫酶基因(sucA)的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)控，在細(xì)胞生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)品的合成中進(jìn)行開(kāi)關(guān)調(diào)控，這種策略中的調(diào)控元件過(guò)于復(fù)雜，往往影響了目的產(chǎn)物合成途徑，而且過(guò)程復(fù)雜難以進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用；二是利用α-酮戊二酸依賴(lài)的雙加氧酶重構(gòu)三羧酸循環(huán)，將目標(biāo)產(chǎn)品的生產(chǎn)與工程菌的生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)起來(lái)，這對(duì)α-酮戊二酸依賴(lài)的雙加氧酶活力有較高要求，而且不適用于生產(chǎn)有一定細(xì)胞毒性的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌，使菌株在三羧酸循環(huán)中斷或無(wú)三羧酸循環(huán)的情況下，在無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中能以葡萄糖或甘油為唯一碳源的有氧生長(zhǎng)。

本發(fā)明首先保護(hù)制備無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌的方法，可包括如下步驟：提高宿主菌中四氫吡啶二羧酸：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰二氨基庚二酸脫乙酰基酶、N-乙酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰同型絲氨酸硫解酶和同型絲氨酸：O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量和/或活性，且降低所述宿主菌中四氫吡啶二羧酸：N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶和同型絲氨酸：O-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量和/或活性，從而獲得無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌；

所述宿主菌為大腸桿菌或突變型大腸桿菌。

上述方法中，所述無(wú)三羧酸循環(huán)的大腸桿菌底盤(pán)菌可在無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基以葡萄糖或甘油為唯一碳源有氧生長(zhǎng)。

上述方法中，所述四氫吡啶二羧酸：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、所述N-乙酰二氨基庚二酸脫乙酰基酶、所述N-乙酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、所述O-乙酰同型絲氨酸硫解酶和所述同型絲氨酸：O-乙酰轉(zhuǎn)移酶均來(lái)源于Bacillus?subtilis?subsp.subtilis?168。

上述方法中，所述“提高宿主菌中四氫吡啶二羧酸：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰二氨基庚二酸脫乙酰基酶、N-乙酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶、O-乙酰同型絲氨酸硫解酶和同型絲氨酸：O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量和/或活性”是通過(guò)向所述宿主菌中導(dǎo)入四氫吡啶二羧酸：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、N-乙酰二氨基庚二酸脫乙酰基酶的編碼基因、N-乙酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因、O-乙酰同型絲氨酸硫解酶的編碼基因和同型絲氨酸：O-乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。