[發明專利]一種無三羧酸循環的大腸桿菌底盤菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202010564730.X
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN113817761B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 林白雪;周航;張譯文;鐘曉彤;劉潔錚;陶勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/54;C12N15/60;C12N1/21;C12P13/14;C12P35/06;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

1.制備無三羧酸循環的大腸桿菌底盤菌的方法，包括如下步驟：向宿主菌中導入四氫吡啶二羧酸：N-乙酰轉移酶的編碼基因、N-乙酰二氨基庚二酸脫乙酰基酶的編碼基因、N-乙酰二氨基庚二酸氨基轉移酶的編碼基因、O-乙酰同型絲氨酸硫解酶的編碼基因和同型絲氨酸：O-乙酰轉移酶的編碼基因且敲除所述宿主菌中四氫吡啶二羧酸：N-琥珀酰轉移酶的編碼基因和同型絲氨酸：O-琥珀酰轉移酶的編碼基因，從而獲得無三羧酸循環的大腸桿菌底盤菌；

所述宿主菌為大腸桿菌或突變型大腸桿菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述突變型大腸桿菌的制備方法為：降低大腸桿菌中α-酮戊二酸脫氫酶、琥珀酰輔酶A合成酶、異檸檬酸裂解酶、丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰轉移酶中至少一個的表達量和/或活性和/或向大腸桿菌中導入T7噬菌體RNA聚合酶編碼基因的表達元件，得到的突變型大腸桿菌。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述降低大腸桿菌中α-酮戊二酸脫氫酶、琥珀酰輔酶A合成酶、異檸檬酸裂解酶、丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰轉移酶中至少一個的表達量和/或活性是通過敲除所述大腸桿菌中α-酮戊二酸脫氫酶的編碼基因、琥珀酰輔酶A合成酶的編碼基因、異檸檬酸裂解酶的編碼基因、丙酮酸氧化酶的編碼基因和磷酸乙酰轉移酶的編碼基因中至少一個來實現的。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述大腸桿菌為BW25113菌株。

5.由權利要求1至4中任一所述的方法制備得到的無三羧酸循環的大腸桿菌底盤菌。

6.權利要求5中所述大腸桿菌底盤菌的應用，為a1)-a4)中的至少一種：

a1)合成以α-酮戊二酸為前體的目的產物；

a2)用于α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶催化合成目的產物；

a3)合成以乙酰輔酶A為前體的目的產物；

a4)合成丙酮酸或以丙酮酸為前體的目的產物。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：

所述以α-酮戊二酸為前體的目的產物為谷氨酸；

所述α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶催化合成的目的產物為脫乙酰氧基頭孢菌素；

所述以乙酰輔酶A為前體的目的產物為乙酰谷氨酸。

8.一種合成谷氨酸的方法，包括如下步驟：

(b1)向權利要求5中所述大腸桿菌底盤菌中導入谷氨酸脫氫酶的編碼基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的編碼基因，得到產谷氨酸的工程菌；

(b2)以葡萄糖或甘油為碳源，發酵培養產谷氨酸的工程菌，收集發酵產物，從中獲得谷氨酸。

9.一種合成脫乙酰氧基頭孢菌素的方法，包括如下步驟：

(c1)向權利要求5中所述大腸桿菌底盤菌中導入脫乙酰氧基頭孢菌素合成酶的編碼基因且敲除β-內酰胺酶的編碼基因，獲得合成脫乙酰氧基頭孢菌素的工程菌；

(c2)以葡萄糖或甘油為碳源，發酵培養合成脫乙酰氧基頭孢菌素的工程菌，收集發酵產物，從中獲得脫乙酰氧基頭孢菌素。

10.一種合成乙酰谷氨酸的方法，包括如下步驟：

(d1)敲除權利要求5中所述大腸桿菌底盤菌中乙酰谷氨酸激酶的編碼基因且導入質粒pNAG06，獲得合成乙酰谷氨酸的工程菌；

(d2)以葡萄糖或甘油為碳源，發酵培養合成乙酰谷氨酸的工程菌，收集發酵產物，從中獲得乙酰谷氨酸。

11.一種合成丙酮酸的方法，可包括如下步驟：以葡萄糖或甘油為碳源，發酵培養權利要求5中所述大腸桿菌底盤菌，收集發酵產物，從中獲得丙酮酸。

12.一種產谷氨酸的工程菌，其制備方法包括如下步驟：向權利要求5中所述大腸桿菌底盤菌中導入谷氨酸脫氫酶的編碼基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的編碼基因，從而獲得產谷氨酸的工程菌。