[發明專利]小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010564384.5
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111707833A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 趙愷;黃棟;沈沈;徐開林
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/58;G01N15/14
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

本發明公開了小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法及其應用，所述方法包括靜脈注射抗CD45抗體、制備單個核細胞、制備流式樣本和分析血管內外淋巴細胞標記情況等步驟。與現有技術相比，本發明具有以下優點：(1)可實現樣本的多標記檢測；(2)可同時檢測多個器官的淋巴細胞情況；(3)實驗結果可靠；(4)操作步驟簡單，耗時短；(5)所述方法應用前景十分廣泛，可以根據淋巴細胞浸潤嚴重程度，作為判斷疾病預后的一個因素。淋巴細胞浸潤情況可以與疾病或腫瘤分型、臨床療法的反應的預測、疾病進展某個環節的調控是否關聯進行分析研究。

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，涉及一種高效、快速、準確的活體小鼠淋巴細胞檢測方法，具體為小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法及其應用。

背景技術

生理情況下，初始T淋巴細胞主要集中在次級淋巴器官(Secondary lymphoidorgan,SLO)比如脾臟和淋巴結，并在血液循環和淋巴循環之間游走發揮免疫監視作用，極少到非淋巴器官中駐留。然而，當機體出現炎癥、腫瘤或者病理損傷時，初始T淋巴細胞活化為效應T細胞。效應細胞在其表達的趨化因子受體作用下，從血管或淋巴管中滲透出來，分布在各個非淋巴器官，包括肝臟、腸道、肺臟、皮膚等。浸潤到非淋巴組織的效應T細胞可在病變部位進一步增殖、分化，與浸潤的其他淋巴細胞群一并停留較長時間，部分效應T細胞可形成記憶T細胞長期存在于非淋巴組織。組織浸潤的淋巴細胞在病變局部發揮重要的免疫應答和調控作用，尤其是對腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的研究近十年來備受關注。現有研究表明，TIL是腫瘤局部免疫微環境的重要部分，對患者的治療和預后具有重要意義，有效獲取和利用TIL甚至被作為一項腫瘤細胞免疫治療的手段在臨床應用。

TIL是異質性淋巴細胞群體，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、DC等，在多種不同腫瘤類型中浸潤的細胞組分也有不同，但CD3⁺T淋巴細胞是公認的組成TIL的主要成分，包括CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞。目前的研究認為，TILs類型和數量與腫瘤治療效果和患者生存率密切相關。因此，有效檢測浸潤到非淋巴組織的淋巴細胞數量，并進一步分析浸潤的淋巴細胞的免疫學特征尤其重要。目前，對非淋巴器官中浸潤淋巴細胞的檢測方法主要有兩種，其一是機械處理或酶消化法獲得單細胞懸液后檢測，其二是對病變組織進行切片利用免疫組化或者免疫熒光染色進行淋巴細胞檢測。此兩種方法均存在一定缺陷，不能將從血管滲出后浸潤到組織中的淋巴細胞和在血管中循環的淋巴細胞進行區分，導致最終的檢測結果為病變局部組織中血管內外混合的所有淋巴細胞，與浸潤到病變實質的淋巴細胞的實際情況偏差較大。建立一種能快速鑒別血管內外淋巴細胞，且能實現對分選的浸潤T細胞進行更深入的免疫學特征和功能檢測的方法具有重要意義。

現有技術中，檢測淋巴細胞浸潤的方法手段有三種，一是制作普通HE染色石蠟切片，顯微鏡觀察浸潤情況；二是免疫組化及免疫熒光方法，DAB顯色，選用特異性一抗標記淋巴細胞；三是流式細胞術檢測。有研究提出，目前利用手術切除的腫瘤標本，不但可以采用免疫組織化學(IHC)技術和多重熒光免疫組織化學(multiplexed fluorescentimmunohistochemistry，m IHC)技術對原位TIC進行表型鑒定和半定量分析，而且還可以采用流式細胞術對分離的TIC進行功能學研究。TIC是指腫瘤浸潤性免疫細胞(tumor-infiltrating immunocyte，TIC)。