[發明專利]小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法及其應用

在審

• 申請號: 202010564384.5
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111707833A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 趙愷;黃棟;沈沈;徐開林
• 申請（專利權）人: 徐州醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/58;G01N15/14
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 余俊杰

1.小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

S1、靜脈注射抗CD45抗體

小鼠經內眥靜脈叢注射抗CD45抗體，注射劑量為3-5μg/只，注射后2.5min眼球取血，3min斷頸處死小鼠并解剖取材，包括淋巴組織和非淋巴組織；

S2、制備單個核細胞

分別制作S1獲得的外周血及解剖獲取組織的單個核細胞；

S3、制備流式樣本

取S2單個核細胞的懸浮液置于流式管中，并向其中加入抗體，室溫避光15-20min，PBS緩沖液洗滌細胞、離心、棄上清、PBS緩沖液重懸細胞，置于流式細胞儀上檢測；

S4、分析血管內外淋巴細胞標記情況

采用流式細胞術分析單個核細胞血管內外的CD45⁺百分比，并以此識別淋巴組織或非淋巴組織中淋巴細胞的位置。

2.根據權利要求1所述的小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，S1中解剖獲取的淋巴組織為淋巴結、脾臟和骨髓，非淋巴組織為肝臟和肺臟。

3.根據權利要求1所述的小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，S1中注射劑量為3μg/只。

4.根據權利要求1所述的小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，S2中單個核細胞的制備方法為：

(1)外周血單個核細胞

小鼠眼球取血后加入小鼠紅細胞裂解液室溫裂解，然后加入PBS緩沖液終止裂解，離心、去上清，殘液彈起后加入PBS緩沖液冰上保存；

(2)淋巴結、脾臟單個核細胞

分別將淋巴結、脾臟混合PBS緩沖液置于篩網中研磨直至篩網中只剩結締組織，分別吸取二者的懸浮液，離心后去上清；其中，淋巴結細胞殘液彈起后加入PBS緩沖液冰上保存，脾臟細胞殘液彈起后加入小鼠紅細胞裂解液室溫裂解，然后加入PBS緩沖液終止裂解，離心、去上清，殘液彈起后加入PBS緩沖液冰上保存；

(3)骨髓單個核細胞

取雙側腿和坐骨，分離脛骨、股骨和坐骨，PBS緩沖液沖出骨髓，吹散后離心、去上清，殘液彈起后加入小鼠紅細胞裂解液室溫裂解，然后加入PBS緩沖液終止裂解，離心、去上清，殘液彈起后加入PBS緩沖液冰上保存；

(4)肝臟單個核細胞

取肝臟混合PBS緩沖液置于篩網中研磨直至篩網中只剩結締組織，吸取細胞懸液離心后取上清，轉移上清液后離心、去上清，殘液彈起后采用40％細胞分離液重懸，然后將懸液加入80％細胞分離液中，升3降3離心，中間細胞層即為單個核細胞，PBS緩沖液洗滌、離心去上清，殘液彈起后加入PBS緩沖液冰上保存；

(5)肺臟單個核細胞

取肝臟混合PBS緩沖液置于篩網中研磨直至篩網中只剩結締組織，吸取細胞懸液離心后去上清，殘液彈起后加入小鼠紅細胞裂解液室溫裂解，然后加入PBS緩沖液終止裂解，離心、去上清，殘液彈起PBS緩沖液洗滌、離心去上清，殘液彈起后加入PBS緩沖液冰上保存。

5.根據權利要求1所述的小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，S3中加入的抗體為CD45-BV570或CD45-APCcy7。

6.根據權利要求1所述的小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，S3中抗體采用熒光標記。

7.根據權利要求1所述的小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法，其特征在于，S4中淋巴組織血管內CD45^-群較CD45⁺占主要成分，而非淋巴組織血管內CD45⁺群較CD45^-群占主要成分。

8.權利要求1-7任一所述小鼠血管內外淋巴細胞識別的方法在判斷小鼠淋巴細胞浸潤程度中的應用。