[發明專利]一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應用

有效

• 申請號: 202010564022.6
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111551663B
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發明（設計）人: 盧偉偉;查全智;張伊蕊;阮宏華
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 南京燦爛知識產權代理有限公司 32356
• 代理人: 李志鴻

1.一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）確定GC-MS的運行參數：選用37種脂肪酸甲酯混合標準品作為外標，在GC-MS上確定儀器運行參數；

2）確定外標中每種脂肪酸甲酯的校正因子：配制含十九烷酸甲酯內標和外標的混合溶液，通過步驟1）所確定的GC-MS運行參數測定該混合溶液，利用校正因子計算公式計算外標中每種脂肪酸甲酯的校正因子，校正因子的計算公式為：f_x=(M_x?A_x)/(M₀?A₀)，

其中，f_x為外標中脂肪酸甲酯的校正因子；M₀為內標的質量，單位為μg；A₀為內標在GC圖譜上的響應值；A_x為該脂肪酸甲酯在GC圖譜上的響應值；M_x為該脂肪酸甲酯的質量，單位為μg；

3）提取土壤中的磷脂脂肪酸并進行甲酯化：采集土壤樣品，采用Bligh-Dyer方法提取土壤中的磷脂脂肪酸，并將提取到的磷脂脂肪酸甲酯化；

4）定性分析樣品：在步驟3）所得到的脂肪酸甲酯中加入內標十九烷酸甲酯，采用步驟1）所確定的GC-MS運行參數測定待測樣品，并對碳原子數為9-19的待測脂肪酸甲酯進行類型的定性分析，并確定碳原子數為9-19的待測脂肪酸甲酯的校正因子；

5）定量分析樣品：結合步驟4）所確定的土壤中碳原子數為9-19的脂肪酸甲酯的校正因子及每種脂肪酸甲酯在GC圖譜上的響應值計算土壤中碳原子數為9-19待測脂肪酸甲酯的濃度，單位為nmol.g^-1，計算公式為：

其中，f為待測脂肪酸甲酯的校正因子；M_i為內標的質量，單位為μg；A_i為內標在GC圖譜上的響應值；A為該脂肪酸甲酯在GC圖譜上的響應值；M_mol為該脂肪酸甲酯的分子摩爾質量，單位為μg.μmol^-1；m為烘干土壤質量，單位為g；

其中，步驟1）中確定GC-MS的運行參數包括以下過程：

（1）吸取購買的37種脂肪酸甲酯混合標準品0.08ml，用正己烷將其稀釋至2ml，即稀釋25倍，稀釋后脂肪酸甲酯的濃度范圍為6.58-24.9μg.ml^-1，然后在GC-MS上進行測定；

（2）進行GC分析，選用VF-23ms色譜柱對脂肪酸甲酯進行測定，載氣為He氣，不分流進樣，進樣體積為1μl，進樣口溫度為260oC；色譜柱箱的升溫程序為：初始溫度為60oC，保持1min；5oC.min^-1升至170oC，保持2min；2oC.min^-1升至200oC，保持5min；

（3）進行MS分析，采用全掃描模式，質荷比掃描范圍為50-500，電子轟擊離子源，電子能量為70eV，離子源溫度為180oC，質譜接口溫度為200oC；

其中，步驟2）中所述的配制含內標十九烷酸甲酯和外標的混合溶液的具體過程如下：選用十九烷酸甲酯為內標，稱取0.002g內標，使用10ml正己烷配制成濃度為200μg.ml^-1的內標溶液；將0.2ml濃度為200μg.ml^-1的內標溶液和0.2ml購買的混合外標溶液混合，用正己烷稀釋至5ml，得到內標濃度為8μg.ml^-1而混合外標的濃度為6.58-24.9μg.ml^-1的混合溶液，吸取2ml該混合溶液加到樣品瓶內進行GC-MS分析；

其中，步驟3）中所述的采用Bligh-Dyer方法提取土壤中磷脂脂肪酸并進行甲酯化，具體包括以下過程：

a.提取土壤脂質：稱取新鮮土壤，該新鮮土壤烘干后為2.00g，首先用15ml Bligh-Dyer提取液對新鮮土壤提取，收集提取液，再次使用7ml Bligh-Dyer提取液進行提取，將2次提取液合并，靜置過夜后，取下層氯仿層，即為提取出的土壤脂質，37oC水浴N₂吹干；

b.分離磷脂脂肪酸：將步驟a所得到的土壤脂質用氯仿溶出，然后加入到硅膠柱中，依次使用5ml氯仿、5ml丙酮和5ml甲醇淋洗硅膠柱，收集甲醇淋洗硅膠柱的淋出液，并在37oC水浴N₂吹干，得到磷脂脂肪酸；

c.甲酯化反應：在步驟b得到的磷脂脂肪酸中加入1ml體積比為1:1的甲苯-甲醇溶劑溶解，然后加入1ml濃度為0.2mol.l^-1的甲醇-KOH溶液，37oC水浴反應30min，最后加入1ml濃度為1mol.l^-1的醋酸停止反應，加入2ml氯仿和2ml水，靜置過夜使其分層，取有機相，37oC水浴N₂吹干，得到待測脂肪酸甲酯；

其中，步驟4）中待測脂肪酸甲酯中加入的內標溶液濃度為3.2μg.ml^-1，體積為0.5ml；

其中，步驟4）中所述定性分析指結合外標中脂肪酸甲酯的保留時間、文獻資料查找和NIST譜庫檢索，對待測樣品中碳原子數為9-19的脂肪酸甲酯的定性分析；

其中，步驟4）中所述確定待測樣品中碳原子數為9-19的脂肪酸甲酯的校正因子的方法如下：外標中包含的脂肪酸甲酯采用步驟2）所計算出的校正因子，對于待測樣品中存在而外標中不包含的脂肪酸甲酯的校正因子的確定原則是采用碳原子數、雙鍵和支鏈的數量和位置均相同的外標中包含的脂肪酸甲酯的校正因子。

2.一種如權利要求1所述的測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法的應用。