[發(fā)明專利]一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010564022.6
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111551663B
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧偉偉;查全智;張伊蕊;阮宏華
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 南京燦爛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32356
• 代理人: 李志鴻

1.一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）確定GC-MS的運(yùn)行參數(shù)：選用37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)，在GC-MS上確定儀器運(yùn)行參數(shù)；

2）確定外標(biāo)中每種脂肪酸甲酯的校正因子：配制含十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)的混合溶液，通過步驟1）所確定的GC-MS運(yùn)行參數(shù)測定該混合溶液，利用校正因子計算公式計算外標(biāo)中每種脂肪酸甲酯的校正因子，校正因子的計算公式為：f_x=(M_x?A_x)/(M₀?A₀)，

其中，f_x為外標(biāo)中脂肪酸甲酯的校正因子；M₀為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，單位為μg；A₀為內(nèi)標(biāo)在GC圖譜上的響應(yīng)值；A_x為該脂肪酸甲酯在GC圖譜上的響應(yīng)值；M_x為該脂肪酸甲酯的質(zhì)量，單位為μg；

3）提取土壤中的磷脂脂肪酸并進(jìn)行甲酯化：采集土壤樣品，采用Bligh-Dyer方法提取土壤中的磷脂脂肪酸，并將提取到的磷脂脂肪酸甲酯化；

4）定性分析樣品：在步驟3）所得到的脂肪酸甲酯中加入內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯，采用步驟1）所確定的GC-MS運(yùn)行參數(shù)測定待測樣品，并對碳原子數(shù)為9-19的待測脂肪酸甲酯進(jìn)行類型的定性分析，并確定碳原子數(shù)為9-19的待測脂肪酸甲酯的校正因子；

5）定量分析樣品：結(jié)合步驟4）所確定的土壤中碳原子數(shù)為9-19的脂肪酸甲酯的校正因子及每種脂肪酸甲酯在GC圖譜上的響應(yīng)值計算土壤中碳原子數(shù)為9-19待測脂肪酸甲酯的濃度，單位為nmol.g^-1，計算公式為：

其中，f為待測脂肪酸甲酯的校正因子；M_i為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量，單位為μg；A_i為內(nèi)標(biāo)在GC圖譜上的響應(yīng)值；A為該脂肪酸甲酯在GC圖譜上的響應(yīng)值；M_mol為該脂肪酸甲酯的分子摩爾質(zhì)量，單位為μg.μmol^-1；m為烘干土壤質(zhì)量，單位為g；

其中，步驟1）中確定GC-MS的運(yùn)行參數(shù)包括以下過程：

（1）吸取購買的37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品0.08ml，用正己烷將其稀釋至2ml，即稀釋25倍，稀釋后脂肪酸甲酯的濃度范圍為6.58-24.9μg.ml^-1，然后在GC-MS上進(jìn)行測定；

（2）進(jìn)行GC分析，選用VF-23ms色譜柱對脂肪酸甲酯進(jìn)行測定，載氣為He氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為1μl，進(jìn)樣口溫度為260oC；色譜柱箱的升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟葹?0oC，保持1min；5oC.min^-1升至170oC，保持2min；2oC.min^-1升至200oC，保持5min；

（3）進(jìn)行MS分析，采用全掃描模式，質(zhì)荷比掃描范圍為50-500，電子轟擊離子源，電子能量為70eV，離子源溫度為180oC，質(zhì)譜接口溫度為200oC；

其中，步驟2）中所述的配制含內(nèi)標(biāo)十九烷酸甲酯和外標(biāo)的混合溶液的具體過程如下：選用十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，稱取0.002g內(nèi)標(biāo)，使用10ml正己烷配制成濃度為200μg.ml^-1的內(nèi)標(biāo)溶液；將0.2ml濃度為200μg.ml^-1的內(nèi)標(biāo)溶液和0.2ml購買的混合外標(biāo)溶液混合，用正己烷稀釋至5ml，得到內(nèi)標(biāo)濃度為8μg.ml^-1而混合外標(biāo)的濃度為6.58-24.9μg.ml^-1的混合溶液，吸取2ml該混合溶液加到樣品瓶內(nèi)進(jìn)行GC-MS分析；

其中，步驟3）中所述的采用Bligh-Dyer方法提取土壤中磷脂脂肪酸并進(jìn)行甲酯化，具體包括以下過程：

a.提取土壤脂質(zhì)：稱取新鮮土壤，該新鮮土壤烘干后為2.00g，首先用15ml Bligh-Dyer提取液對新鮮土壤提取，收集提取液，再次使用7ml Bligh-Dyer提取液進(jìn)行提取，將2次提取液合并，靜置過夜后，取下層氯仿層，即為提取出的土壤脂質(zhì)，37oC水浴N₂吹干；

b.分離磷脂脂肪酸：將步驟a所得到的土壤脂質(zhì)用氯仿溶出，然后加入到硅膠柱中，依次使用5ml氯仿、5ml丙酮和5ml甲醇淋洗硅膠柱，收集甲醇淋洗硅膠柱的淋出液，并在37oC水浴N₂吹干，得到磷脂脂肪酸；

c.甲酯化反應(yīng)：在步驟b得到的磷脂脂肪酸中加入1ml體積比為1:1的甲苯-甲醇溶劑溶解，然后加入1ml濃度為0.2mol.l^-1的甲醇-KOH溶液，37oC水浴反應(yīng)30min，最后加入1ml濃度為1mol.l^-1的醋酸停止反應(yīng)，加入2ml氯仿和2ml水，靜置過夜使其分層，取有機(jī)相，37oC水浴N₂吹干，得到待測脂肪酸甲酯；

其中，步驟4）中待測脂肪酸甲酯中加入的內(nèi)標(biāo)溶液濃度為3.2μg.ml^-1，體積為0.5ml；

其中，步驟4）中所述定性分析指結(jié)合外標(biāo)中脂肪酸甲酯的保留時間、文獻(xiàn)資料查找和NIST譜庫檢索，對待測樣品中碳原子數(shù)為9-19的脂肪酸甲酯的定性分析；

其中，步驟4）中所述確定待測樣品中碳原子數(shù)為9-19的脂肪酸甲酯的校正因子的方法如下：外標(biāo)中包含的脂肪酸甲酯采用步驟2）所計算出的校正因子，對于待測樣品中存在而外標(biāo)中不包含的脂肪酸甲酯的校正因子的確定原則是采用碳原子數(shù)、雙鍵和支鏈的數(shù)量和位置均相同的外標(biāo)中包含的脂肪酸甲酯的校正因子。

2.一種如權(quán)利要求1所述的測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法的應(yīng)用。