[發(fā)明專利]一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010564022.6
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111551663B
• 公開（公告）日: 2023-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧偉偉;查全智;張伊蕊;阮宏華
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/86
• 代理公司: 南京燦爛知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32356
• 代理人: 李志鴻

本發(fā)明提供了一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應(yīng)用，本發(fā)明利用37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品作為外標(biāo)，在GC?MS上確定運行參數(shù)，建立測定脂肪酸甲酯的方法，采用十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)和37種脂肪酸甲酯外標(biāo)的混合溶液確定外標(biāo)中脂肪酸甲酯的校正因子，提取土壤中磷脂脂肪酸并進(jìn)行甲酯化，結(jié)合外標(biāo)中脂肪酸甲酯的保留時間和NIST譜庫檢索，對待測樣品中碳原子數(shù)為9?19的脂肪酸甲酯進(jìn)行類型的定性分析，利用前述所得外標(biāo)中脂肪酸甲酯的校正因子并結(jié)合待測脂肪酸甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)確定樣品中碳原子數(shù)為9?19的脂肪酸甲酯的校正因子，最后通過得出的校正因子計算土壤中碳原子數(shù)為9?19的脂肪酸甲酯的含量，從而實現(xiàn)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)更準(zhǔn)確的表征。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及化合物檢測技術(shù)，特別涉及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測化合物的技術(shù)，具體來說是一種檢測土壤中脂肪酸甲酯的定量方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

磷脂脂肪酸(PLFAs)是細(xì)胞膜的組成成分之一，由于不同種類微生物所含有的PLFAs的種類不同，利用PLFAs的組成來表征土壤微生物群落結(jié)構(gòu)已被廣泛應(yīng)用。為了提高待測物質(zhì)的穩(wěn)定性以及降低其沸點使其更容易氣化，一般需要將PLFAs衍生化為相應(yīng)的甲酯，即脂肪酸甲酯FAME，然后測試其成分和含量。測定FAME的常用儀器包括氣象色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，其中，美國MIDI公司開發(fā)的SherlockMicrobial Identification System(MIS)就是在氣象色譜儀的平臺上(如Agilent公司的GC-6850,7820,6890和7890)對微生物中特定短鏈脂肪酸(C9-C20)形成FAME的種類和含量進(jìn)行鑒定和分析的軟件。盡管利用該軟件能對大批量樣品進(jìn)行快速檢測，但仍存在數(shù)據(jù)庫中缺少待檢測的FAME以及色譜峰誤判的情況，并且購買MIDI軟件的費用相對比較昂貴。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀能夠分析FAME的極性磷酸頭部，也能夠分析FAME的非極性脂肪酸側(cè)鏈，能展示最初活體細(xì)胞膜磷脂分子所承載的全部信息。但是，由于目前尚沒有商業(yè)化的譜庫可供用戶檢索，其在FAME檢測方面的應(yīng)用還不夠廣泛。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)用于檢測FAME具有高的靈敏度、低檢測限，并且具有商業(yè)化的NIST譜庫可供檢索，具有良好的應(yīng)用前景。

目前，對FAME進(jìn)行定量的方法主要包括面積歸一化法、內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法等。面積歸一化法是在所有組分的校正因子相同的條件下，將待測樣品所有出峰組分的含量按100％計，根據(jù)響應(yīng)值計算每個組分的百分含量。這種方法計算簡便，并且能消除因儀器狀態(tài)和運行條件的差異而帶來的誤差。但是，該方法不能得到待測組分的絕對含量。內(nèi)標(biāo)法直接使用待測組分和內(nèi)標(biāo)(一般為十九烷酸甲酯)的響應(yīng)值(峰面積或峰高)的比值以及內(nèi)標(biāo)的含量確定待測組分的含量，但是沒有考慮不同F(xiàn)AME對儀器的響應(yīng)存在差異。外標(biāo)法則是通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算樣品中待測FAME的含量。但是，由于目前市場上銷售的FAME混合標(biāo)準(zhǔn)品不能包含從土壤中所提取的全部目標(biāo)FAME，該方法不能對土壤所特有的FAME進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

任慧琴等(2014)發(fā)表的文章“土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析中磷脂脂肪酸法和溫和堿性甲酯化法的比較及定量優(yōu)化”(環(huán)境化學(xué),33(5):760-764)分別使用“內(nèi)標(biāo)對比法”(同時使用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo))和“直接計算法”(依據(jù)樣品含量和峰面積呈正比的原理)兩種方法對土壤FAME進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)兩者存在差異，進(jìn)而通過兩者的比值計算出校正系數(shù)，并對只能用于“直接計算法”的組分進(jìn)行校正，使得沒有標(biāo)準(zhǔn)品的FAME仍能定量，優(yōu)化了利用GC-MS測定FAME的定量方法。然而，該方法仍然存在以下不足：第一，雖然“內(nèi)標(biāo)對比法”考慮了不同F(xiàn)AME對GC-MS的響應(yīng)不同，但用于定量的公式默認(rèn)樣品中和內(nèi)外標(biāo)混合溶液中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量相同，限制了公式的應(yīng)用；第二，外標(biāo)中沒有包含的FAME的校正因子，使用的是已知的所有FAME的校正因子的平均值，平均化處理在某種程度上會使誤差增大。因此，有必要進(jìn)一步優(yōu)化土壤脂肪酸甲酯的定量方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，建立一種測定土壤脂肪酸甲酯的定量方法及其應(yīng)用，從而實現(xiàn)對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)更準(zhǔn)確的表征。