[發(fā)明專利]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010562713.2
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111850032A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 欒雨時;洪雨慧;賀曉麗;張媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 大連格智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

本發(fā)明涉及番茄轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建，旨在提供一種運用CRISPR?Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的基因編輯方法。包括：選擇sgRNA靶位點進行克隆，將多個sgRNA表達框架構(gòu)建到一個載體上，可用于真核表達；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化番茄愈傷組織獲得轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)苗，獲得轉(zhuǎn)基因陽性株系；還提供了利用CRISPR?Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的應(yīng)用方法，培育抗晚疫病番茄植株。本發(fā)明方法得到的轉(zhuǎn)基因植株中miR482b和miR482c的表達量低于野生型植株，其抗晚疫病效果更優(yōu)。本發(fā)明通過沉默miR482b和miR482c基因使番茄對晚疫病的抗性增強，對培育抗晚疫病番茄品種具有重要意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及番茄轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建，具體涉及利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默miR482b和miR482c及應(yīng)用。

背景技術(shù)

番茄是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟、園藝作物。在其生長過程中，由各種病原物引起的植物病害，嚴重影響了番茄的產(chǎn)量，造成了巨大的經(jīng)濟損失。近年來，晚疫病成為最嚴重的番茄病害之一，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展造成了重大損失。雖然化學(xué)農(nóng)藥對晚疫病的發(fā)生和蔓延有一定的控制作用，但由此引發(fā)的環(huán)境污染，病原菌抗藥性等問題，依舊給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的困擾，因此，研究番茄抗病的分子機制，用生物學(xué)方法提高番茄對晚疫病的抗性成為了關(guān)鍵問題。

miRNA一類短的、內(nèi)源性的調(diào)控基因表達的單鏈RNA分子，其長度約為20-23個核苷酸。miRNA通過在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，在植物的生命過程中扮演了負調(diào)節(jié)因子的角色。已有大量研究表明miRNA在響應(yīng)生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用。例如，在水稻中，miR160a和miR398b的過表達增強了植物對稻瘟病菌的抗性。在擬南芥中，抑制miR773活性可有效提高植物對真菌病原體的抗性。在晚疫病感染番茄前后，鑒定出70種差異表達的miRNA，其中miR1916已被證明是植物抗晚疫病和灰霉病的負調(diào)控因子。

miR482超家族成員被確定為NBS-LRR抗病基因的潛在調(diào)控因子；在本氏煙草的瞬時表達實驗發(fā)現(xiàn)，miR482靶向氮端含有雙螺旋結(jié)構(gòu)域的NBS-LRR抗病基因的mRNA，導(dǎo)致其降解，并引發(fā)級連式調(diào)控反應(yīng)，在植物抗病過程中發(fā)揮重要的作用。在番茄中的研究發(fā)現(xiàn)晚疫病菌侵染后miR482b的豐度降低，過表達miR482b的番茄植株在晚疫病菌感染后病害癥狀加重，表現(xiàn)為壞死細胞增多、病害直徑變長以及晚疫病菌的豐度增加，短串聯(lián)靶向模擬(STTM)沉默miR482b增強了番茄對晚疫病菌的抗性。

近年來，基于RNA介導(dǎo)的CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)-Cas9(CRISPR-associated protein9)系統(tǒng)蓬勃發(fā)展起來，該系統(tǒng)可定點修飾(刪除、添加、激活、抑制)靶細胞中特定的基因序列，為靶向性編輯基因組序列提供行之有效的技術(shù)手段。自從2013年年在植物基因組編輯中首次得到證明以來，它已得到不斷改進和廣泛用于編輯許多植物的基因組但是，目前尚無運用該技術(shù)沉默番茄MIRNA基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的基因編輯方法，并提供該方法在番茄抗晚疫病中的應(yīng)用方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明的解決方案包括以下步驟：

(1)根據(jù)CRISPR-Cas9技術(shù)的設(shè)計靶位點的原則，把第一個靶位點設(shè)計在MIR482b基因的過客鏈上，第二個靶點設(shè)計在MIR482b基因的成熟體序列上，第三個靶位點設(shè)計在MIR482c基因的過客鏈上，第四個靶點設(shè)計在MIR482c基因的成熟體序列上；

sgRNA的核苷酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；