[發(fā)明專利]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010562713.2
• 申請日: 2020-06-19
• 公開（公告）號: CN111850032A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 欒雨時;洪雨慧;賀曉麗;張媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 大連格智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 21238
• 代理人: 劉琦

1.利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的基因編輯方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)根據(jù)CRISPR-Cas9技術(shù)的設(shè)計靶位點的原則，把第一個靶位點設(shè)計在MIR482b基因的過客鏈上，第二個靶點設(shè)計在MIR482b基因的成熟體序列上，第三個靶位點設(shè)計在MIR482c基因的過客鏈上，第四個靶點設(shè)計在MIR482c基因的成熟體序列上；

sgRNA的核苷酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

(2)人工合成AtU6啟動子序列、Streptococcus pyogenes Cas9序列；

(3)將sgRNA靶位點引物退火后形成的帶有粘性末端的核心序列排列組裝，與AtU6，35S，SpCas9片段一起構(gòu)建于一個植物雙元表達載體pBI121骨架載體上，獲得以下載體骨架：AtU6：：sgRNA-35S：：SpCas9；

(4)獲得完整的番茄CRISPR-Cas9編輯載體CR-mir482b,c。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的應(yīng)用方法，其特征在于，用于培育抗晚疫病番茄植株。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的應(yīng)用方法，其特征在于，通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

將重組表達載體CR-mir482b,c轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101并涂布在含有卡那霉素、鏈霉素及利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進行菌液PCR驗證；

選取陽性工程菌侵染預(yù)培養(yǎng)后的番茄子葉，共培養(yǎng)，分化出芽；

將抗性芽移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根后移栽，PCR驗證轉(zhuǎn)基因植株；

對沉默miR482b和miR482c的番茄苗進行抗病性檢測，得到抗晚疫病番茄植株。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默番茄miR482b和miR482c的應(yīng)用方法，其特征在于，所述重組表達載體CR-mir482b,c由將所述CRISPR-Cas9系統(tǒng)同時沉默miR482b和miR482c得到。