[發明專利]一種將肝細胞誘導為肝癌細胞的基因組合及其應用

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• 申請號: 202010560770.7
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111635912A
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 深圳市體內生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A01K67/027;A61K49/00;C12Q1/18
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種將肝細胞誘導為肝癌細胞的基因組合，其特征在于，所述基因組合包括TP53突變基因和c-MYC基因。

2.根據權利要求1所述的基因組合，其特征在于，所述基因組合還包括NRAS突變基因、KRAS突變基因、Hyper-IL6基因、BRAF基因、CTNNB1基因或ERBB4基因中的任意一種或至少兩種的組合，優選為NRAS突變基因和/或KRAS突變基因；

優選地，所述肝細胞包括人原代肝細胞。

3.一種基因轉染載體，其特征在于，所述基因轉染載體含有權利要求1或2所述的基因組合；

優選地，所述基因轉染載體為基因過表達載體，包括慢病毒載體、Piggybac載體或TetOn誘導性載體中的任意一種，優選為慢病毒載體。

4.一種人肝癌細胞，其特征在于，所述人肝癌細胞為基因組中整合有權利要求1或2所述的基因組合的人原代肝細胞；

優選地，所述人肝癌細胞中包括權利要求3所述的基因轉染載體。

5.一種人肝癌細胞的構建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

采用攜帶權利要求1或2所述的基因組合的慢病毒載體和包裝質粒共轉染包裝細胞，得到慢病毒溶液；

以人原代肝細胞為母細胞，將所述慢病毒溶液與人原代肝細胞混合培養，在所述人原代肝臟細胞過表達所述基因組合，誘導肝癌形成得到所述人肝癌細胞。

6.根據權利要求5所述的人肝癌細胞的構建方法，其特征在于，所述包裝細胞包括293T細胞或PlatE細胞；

優選地，所述慢病毒載體與包裝質粒的質量比為(2～4):5，優選為3:5；

優選地，所述包裝質粒包括psPAX2和pMD2.G；

優選地，所述psPAX2和pMD2.G的質量比為(3～5):1，優選為4:1；

優選地，所述混合培養的時間為36～60h，優選為48h；

優選地，所述人原代肝細胞與慢病毒溶液混合前經過預處理，所述預處理的操作為：將所述人原代肝細胞置于肝細胞培養基中，培養24～48小時；

優選地，所述人原代肝細胞的培養條件為在36～37℃、4.5～5.5％CO₂下培養。

7.一種原發性肝癌人源化動物模型，其特征在于，所述人肝癌模型為移植有權利要求3所述的基因轉染載體感染的人原代肝細胞的生物體；

優選地，所述生物體為肝臟自發或可誘導損傷的免疫缺陷動物，包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一種免疫缺陷小鼠，優選為NSIF小鼠。

8.一種構建原發性肝癌人源化動物模型的方法，其特征在于，所述方法包括：

以人原代肝細胞為母細胞，并用攜帶權利要求1或2所述的基因組合的慢病毒載體和包裝質粒共轉染包裝細胞，得到慢病毒溶液；

再將所述慢病毒溶液與人原代肝細胞混合培養，再經體外培養確認基因組合轉入后、肝癌細胞形成前移植到實驗動物體內，飼養后得到所述原發性肝癌人源化動物模型。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述實驗動物包括肝臟自發或可誘導損傷的免疫缺陷實驗動物；

優選地，所述實驗動物包括TK-NOG、uPA-SCID、FRG、FRGN或NSIF中任意一種的免疫缺陷小鼠；

優選地，所述免疫缺陷小鼠為Fah-/-缺陷的免疫缺陷小鼠，優選為NOD-SCID IL2rg-/-Fah-/-小鼠；

優選地，所述移植的方法包括脾臟注射或肝原位注射；

優選地，所述飼養的時間為60～180天，優選為120～180天；

優選地，得到所述原發性肝癌人源化模型后還包括病理鑒定的操作；

優選地，所述病理鑒定包括：腫瘤形成后，解剖剝取小鼠的肝臟或脾臟組織，檢測組織病理特征和腫瘤所屬類型。

10.如權利要求1或2所述的基因組合、權利要求3所述的基因轉染載體、權利要求4所述的人肝癌細胞或權利要求7所述的原發性肝癌人源化動物模型在研究肝癌發病機制、篩選肝癌藥物或評估肝癌治療手段中的應用。