[發(fā)明專(zhuān)利]一種攜帶修飾的小RNA的建庫(kù)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010558491.7
• 申請(qǐng)日: 2020-06-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113817803A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃鵬羽;王鶴鳴;黃榮;李玲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 上海光華專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 朱凌嬌;許亦琳

本發(fā)明提供一種攜帶修飾的小RNA的建庫(kù)方法，至少包括如下步驟：1）利用去甲基化試劑去除攜帶修飾的小RNA的甲基化修飾；2）利用第一轉(zhuǎn)化劑使攜帶修飾的小RNA的5’端的5’?OH轉(zhuǎn)化為5’P，3’P端轉(zhuǎn)化為3’?OH；3）利用第二轉(zhuǎn)化劑使攜帶修飾的小RNA的5’端的5?cap轉(zhuǎn)化為5’P；4）將攜帶修飾的小RNA上連接測(cè)序接頭；5）利用包括逆轉(zhuǎn)錄酶在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄試劑將攜帶修飾的小RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；6）將cDNA純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得攜帶修飾的小RNA的測(cè)序文庫(kù)。本發(fā)明提供了一種新的小RNA建庫(kù)方法為攜帶修飾的小RNA提供了一個(gè)強(qiáng)大的靈敏的分析工具進(jìn)而為生命體內(nèi)豐富復(fù)雜的攜帶修飾小RNA的功能及其在生理病理等過(guò)程中的角色扮演奠定堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因測(cè)序領(lǐng)域，特別是涉及一種攜帶修飾的小RNA的建庫(kù)方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

非編碼RNA中包含多種小RNA如siRNA、miRNA、piRNA等，它們組成了細(xì)胞中高度復(fù)雜的小RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在調(diào)節(jié)個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗病毒等整個(gè)細(xì)胞水平幾乎所有事件中起著重要的調(diào)控作用。

近年來(lái)隨著高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)的發(fā)展，我們認(rèn)識(shí)了細(xì)胞中豐富的RNA世界。同時(shí)大量的新類(lèi)型的小RNA在不同的物種中被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其中有tsRNA(tRNA來(lái)源的小RNA)，rsRNA(rRNA來(lái)源的小RNA)，rasiRNA(重復(fù)相關(guān)的siRNA)，hcRNA(異染色質(zhì)RNA)和PASR/TASR(啟動(dòng)子終止子相關(guān)的小RNA)等。傳統(tǒng)的RNA-seq是在RNA的末端加上接頭，再利用與3’端接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。這種方法適用于結(jié)構(gòu)特征為5’-磷酸基團(tuán)，3’-羥基基團(tuán)的轉(zhuǎn)錄本，絕大多數(shù)miRNA符合此類(lèi)結(jié)構(gòu)，故針對(duì)miRNA的測(cè)序技術(shù)相對(duì)成熟。然而，對(duì)于末端或內(nèi)部攜帶修飾的小RNA，由于其會(huì)干擾末端接頭的連接或阻礙反轉(zhuǎn)錄進(jìn)程，從而使得大量帶修飾的小RNA不能被成功建庫(kù)，進(jìn)而被當(dāng)做垃圾片段而忽略。2015年《NatureMethods》上的兩篇文章通過(guò)在文庫(kù)制備前用酶處理去除tRNA的修飾，解決了tRNA測(cè)序的技術(shù)難題。同時(shí)，該方法發(fā)掘了大量攜帶甲基化修飾核苷的tRNA-fragment。很多研究表明tRNA也能被切割成更小的RNA，其豐度甚至比microRNA更豐富。tRNA-fragment的相關(guān)研究表明其參與了細(xì)胞增殖，腫瘤形成，干細(xì)胞發(fā)育，跨代遺傳等過(guò)程。這些研究成果都說(shuō)明，生命體中存在著豐富的攜帶修飾的小RNA，它們蘊(yùn)藏大量的生物學(xué)信息與機(jī)體發(fā)育，腫瘤形成等多種生理病理的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，亟待進(jìn)一步被發(fā)掘研究。

建立能夠捕獲末端及內(nèi)部攜帶修飾的小RNA建庫(kù)方法是發(fā)掘和完善小RNA及深入研究其潛在功能的首要待攻克技術(shù)壁壘。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶修飾的小RNA的建庫(kù)方法及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種攜帶修飾的小RNA的建庫(kù)方法，至少包括如下步驟：

1)利用去甲基化試劑去除攜帶修飾的小RNA的甲基化修飾；

2)利用第一轉(zhuǎn)化劑使攜帶修飾的小RNA的5’端的5’-OH轉(zhuǎn)化為5’P，3’P端轉(zhuǎn)化為3’-OH；

3)利用第二轉(zhuǎn)化劑使攜帶修飾的小RNA的5’端的5-cap轉(zhuǎn)化為5’P；

4)將攜帶修飾的小RNA上連接測(cè)序接頭；

5)利用包括逆轉(zhuǎn)錄酶在內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄試劑將攜帶修飾的小RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；

6)將cDNA純化后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得攜帶修飾的小RNA的測(cè)序文庫(kù)。

本發(fā)明第二方面提供前述攜帶修飾的小RNA的建庫(kù)方法在基因測(cè)序領(lǐng)域中的用途。