[發(fā)明專利]適用于美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應(yīng)體系

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010558367.0
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111621550B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張正;于永翔;陳京;王印庚;廖梅杰;榮小軍;張浩
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 北京開陽星知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11710
• 代理人: 姚金金

本發(fā)明屬于海水養(yǎng)殖病害防控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應(yīng)體系。通過設(shè)計特異性引物進行重組酶聚合酶擴增反應(yīng)，對產(chǎn)物進行凝膠電泳驗證后，根據(jù)是否有目的條帶出現(xiàn)定性判斷檢測樣品是否含有美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種。本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定、特異、高效的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種重組酶聚合酶擴增(RPA)反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系對美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種具有特異性，在此基礎(chǔ)上開展美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種RPA檢測技術(shù)研究，為實現(xiàn)美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種精準、快速的RPA檢測奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于海水養(yǎng)殖病害防控技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應(yīng)體系。

背景技術(shù)

美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)廣泛分布于全球海洋環(huán)境中，是弧菌科(Vibrionaceae)發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)的一種重要致病菌，包括美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(P.damselae subsp.damselae,PDD)和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(P.damselae subsp.piscicida,PDP)兩個亞種，其中殺魚亞種只感染魚類，而美人魚亞種不僅可以感染多種海洋動物，還可以感染人發(fā)病。美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種由美國科學家于1981年首次報道，隨后世界各地陸續(xù)有該菌感染魚類、甲殼類、軟體動物、海龜、鯨魚和海豚等不同海洋動物發(fā)病的案例。1982年，The Lancet雜志首次報道了美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染人發(fā)病的案例，在這之后日本、美國、中國香港、沙特阿拉伯等地的科學家多次報道了該菌感染人發(fā)病并致死的病例。現(xiàn)有的研究已經(jīng)證實，美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種是一種來自海洋環(huán)境的、對人有致死能力的人魚共患病原。該菌在海洋環(huán)境中廣泛分布，不僅會對海水養(yǎng)殖生產(chǎn)造成經(jīng)濟損失，還會對海水養(yǎng)殖從業(yè)者、浴場旅游人員、海上作業(yè)人員等構(gòu)成一些潛在的公共衛(wèi)生風險，應(yīng)引起足夠的重視。

在前期的研究過程中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種在我國的海水養(yǎng)殖環(huán)境中普遍存在，可以感染石斑魚、鲆鰈類、許氏平鲉等多種魚類，沒有明顯的地域或宿主特異性。為了更好的防控該菌的感染和傳播擴散，研發(fā)其精準、快速的檢測技術(shù)尤為重要，可以為臨床的診治提供重要的技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種在海洋環(huán)境中廣泛分布，不僅會對海水養(yǎng)殖生產(chǎn)造成經(jīng)濟損失，還會對海水養(yǎng)殖從業(yè)者、浴場旅游人員、海上作業(yè)人員等構(gòu)成一些潛在的公共衛(wèi)生風險，必須防控該菌的感染和傳播擴散。

為解決上述問題，我們提供了一種穩(wěn)定、特異、高效的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種重組酶聚合酶擴增(RPA)反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系對美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種具有特異性，在此基礎(chǔ)上開展美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種RPA檢測技術(shù)研究，為實現(xiàn)美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種精準、快速的RPA檢測奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

為達到上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：適用于美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應(yīng)體系，通過設(shè)計特異性引物進行重組酶聚合酶擴增反應(yīng)，對產(chǎn)物進行凝膠電泳驗證后，根據(jù)是否有目的條帶出現(xiàn)定性判斷檢測樣品是否含有美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種。

進一步的，所述特異性引物是基于美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的Mcp基因設(shè)計的，分別為DNA正向序列：PDDF:5’-CTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAG-3’和反向序列：PDDR：5’-GCGACTTTGCTCGATAGCCGCTACGGCATTG-3’，運用該特異性引物擴增的Mcp基因的目的片段長度為300bp。

這對引物序列是我們測定美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的全基因組序列后，通過對基因組數(shù)據(jù)庫的分析，篩選Mcp基因的部分序列作為目標片段(劃線部分，其中斜體部分為本發(fā)明的引物)。美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的Mcp基因序列全長如下：