[發明專利]適用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系

有效

• 申請號: 202010558367.0
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111621550B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發明（設計）人: 張正;于永翔;陳京;王印庚;廖梅杰;榮小軍;張浩
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 姚金金

1.用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系，其特征在于：通過設計特異性引物進行重組酶聚合酶擴增反應，對產物進行凝膠電泳驗證后，根據是否有目的條帶出現定性判斷檢測樣品是否含有美人魚發光桿菌美人魚亞種；

其中，DNA正向序列：PDDF:5’-CTGTCTCATGATGTGGCCCAAGTAAGTGAAG-3’和反向序列：PDDR：5’-GCGACTTTGCTCGATAGCCGCTACGGCATTG-3’；

用于檢測的RPA反應體系總體積為46.5μL，包含2×Reaction Buffer緩沖液25μL，10×Basic E-mix5μL，上述濃度為10μM的PDDF和PDDR引物各2.4μL，dNTP酶9.2μL，20×CoreReaction Mix 2.5μL。

2.如權利要求1所述的用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系，其特征在于：所述特異性引物基于美人魚發光桿菌美人魚亞種的Mcp基因設計，運用該特異性引物擴增的Mcp基因的目的片段長度為300bp。

3.一種權利要求1所述用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)在無菌的200μL PCR管中分別加入濃度10μM的美人魚發光桿菌美人魚亞種正向引物PDDF和反向引物PDDR各2.4μL；

(2)在上述PCR管中依次加入2×Reaction Buffer 25μL，dNTPs+ddH₂O 9.2μL，10×Basic E-mix 5μl，震蕩混合均勻；

(3)向上述預混液中加入2.5μL 20×Core Reaction Mix4，再次震蕩混合均勻，即獲得所述的適用于美人魚發光桿菌美人魚亞種RPA快速檢測的反應體系。

4.一種權利要求1所述用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系在制備美人魚發光桿菌美人魚亞種RPA檢測制品中的應用。

5.一種用權利要求1所述用于美人魚發光桿菌美人魚亞種快速檢測的RPA反應體系檢測美人魚發光桿菌美人魚亞種RPA的方法，所述方法為非診斷目的，其特征在于包括以下步驟：

(1)首先將預混好的美人魚發光桿菌美人魚亞種RPA反應體系凍干后，進行密封保存；

(2)進行檢測時，打開密封的裝有凍干反應體系的PCR管，并加入46.5μL中的ddH₂O，輕微振蕩，直至反應體系全部溶解；

(3)隨后在溶解的反應體系中，依次加入2.5μL的280mM MgOAc和1μL檢測樣本DNA模板，使反應體系總體積達到50μL，蓋上PCR管蓋，并用封口膜進行密封；

(4)將密封好的PCR管放置手心處，握拳以維持溫度約37℃至20min就可以完成擴增反應，擴增好的檢測產物通過凝膠電泳進行驗證和拍照，完成RPA檢測。