[發明專利]一種用于copA和czcD基因雙重熒光定量PCR檢測的引物和探針組及試劑盒

在審

• 申請號: 202010558138.9
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111944880A
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 汪華;王群;孫達;宋亞麗;陳勇民;薛向東
• 申請（專利權）人: 浙江科技學院
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種用于copA和czcD基因雙重熒光定量PCR檢測的引物和探針組及試劑盒；引物組包括用于檢測copA基因的上游引物，如SEQ ID NO.1所示；下游引物，如SEQ ID NO.2所示；探針，如SEQ ID NO.3所示。用于檢測czcD基因的上游引物，如SEQ ID NO.4所示；下游引物，如SEQ ID NO.5所示；探針，如SEQ ID NO.6所示；探針的5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團；試劑盒包括：PCR反應液、混合酶液、陽性標準品、弱陽性質控品和強陽性質控品；該試劑盒通過特異性的引物和探針、在PCR反應陰性對照、弱陽性質控品、強陽性質控品的監控下，與陽性標準品進行同步測定，測得的結果具有靈敏度高、準確度高的特點。

技術領域

本發明涉及一種用于copA和czcD基因雙重熒光定量PCR檢測的引物和探針組及試劑盒，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

當前，環境重金屬污染越來越受到人們的關注。相對于有機污染而言，土壤重金屬污染持續時間長，無法通過土壤自然過程降解，對環境的危害更持久，從而影響土壤微生物的構成。

銅和鎘是我國土壤重金屬污染中比較典型的兩種重金屬元素，有時會產生聯合污染。重金屬污染會對土壤細菌產生選擇壓力，進而影響土壤細菌的構成和數量。copA是編碼多重抗銅氧化酶的基因，廣泛存在于耐銅細菌中，可作為耐銅細菌的遺傳標記物。czcD是編碼陽離子外排蛋白，從而緩解土壤重金屬鎘對細菌的毒性。因而，可以通過測定重金屬耐受基因的數量，來分析重金屬對土壤細菌的影響。

土壤本身也是重金屬耐受基因的一個重要庫，但是，傳統的定量檢測方法，主要是基于微生物培養測序，缺乏相對有力的手段來確定耐受基因的數量。隨著實時熒光PCR檢測技術的發展，特別是探針法的進步，能及時確定土壤中耐受基因的數量，對于控制環境重金屬污染，分析細菌重金屬耐受性具有積極意義。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的第一個目的在于提供一種用于copA和czcD基因雙重熒光定量PCR檢測的引物和探針組，該引物和探針組可配合對copA和czcD基因特異性的核酸片段體現出良好的擴增效率。

本發明的第二個目的在于提供一種試劑盒，該試劑盒通過特異性的引物和探針、在PCR 陰性對照、弱陽性質控品、強陽性質控品的監控下，與陽性標準品同步檢測，測得的結果具有靈敏度高、準確度高的特點。

實現本發明的第一個目的通過采取如下技術方案達到：

一種用于copA和czcD基因雙重熒光定量PCR檢測的引物和探針組，包括，

上游引物copA-F：5’ATYGAGCTKCATYTGACCGG 3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物copA-R：5’ATYTTCMAGKTCRCTCCACATGCC 3’，如SEQ ID NO.2所示；

探針copA-P：5’TGSATBGGRTGSGYCATCATVSTGTC 3’，如SEQ ID NO.3所示；探針的5’端標記有FAM熒光基團，3’端標記BHQ1基團。

上游引物czcD-F：5’CGACGCCGCGCACATG 3’，如SEQ ID NO.4所示；

下游引物czcD-R：5’TANCCSSCGACGCCGA 3’，如SEQ ID NO.5所示；

探針czcD-P：5’CCGCGCCGARRTSCTCG 3’，如SEQ ID NO.6所示；探針的5’端標記有VIC熒光基團，3’端標記有BHQ1基團。

進一步地，引物和探針根據copA基因片段保守區進行設計，該靶片段的序列如SEQID NO.7所示；引物和探針根據czcD基因片段保守區進行設計，該靶片段的序列如SEQ ID NO.8所示。