[發明專利]一種合成mcl-PHA的四種微生物混合發酵方法

在審

• 申請號: 202010558079.5
• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111676253A
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 賈曉強;李蘇航
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12P39/00;C12N1/20;C12N1/16;C12R1/40;C12R1/685;C12R1/865;C12R1/02
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

本發明涉及一種合成mcl?PHA的四種微生物混合發酵方法。四種微生物為重組菌P.putida?acs KT2440；A.niger為中國微生物普通菌種保藏中心編號3.3928；釀酒酵母為S.cerevisiae L2612；醋酸桿菌經測序鑒定為A.orientalis。以淀粉為初始底物，先被A.niger水解為含葡萄糖的水解液，然后在S.cerevisiae L2612與A.orientalis混合發酵作用下生成含乙酸發酵液，最后P.putida?acsKT2440以乙酸為底物合成終產物mcl?PHA。通過人工構建混菌體系，將生物反應變成簡單模塊化工作，減少物質多級流動及能量消耗。

技術領域

本發明提供一種合成mcl-PHA的微生物發酵方法。特別是涉及一種合成mcl-PHA的四種微生物混合發酵方法。

背景技術

在幾種正在開發的可生物降解的聚合物中，PHA由于其性能和與常規石油化學衍生塑料的相似性而受到了廣泛關注^[1]。目前正在研究不同的PHA在藥物，縫線的控制釋放，縫線，在骨板，傷口敷料，醫療輔助設備和治療設備中的潛在應用，根據其結構特征將其最初分為兩組^[2,3]，對于中鏈長度的PHA(mcl-PHA)，是具有6至14個碳原子的單體聚合物，高生產成本是生產PHA的主要缺點之一。因此，已經進行了許多努力來通過改善細菌，有效的發酵和回收過程來降低生產PHA的成本，中鏈長度的聚羥基鏈烷酸酯(mcl-PHA)是主要由革蘭氏陰性細菌合成的聚酯。他們的大部分研究工作都集中在使用假單胞菌作為微生物細胞工廠。報道了油假單胞菌和其他熒光假單胞菌生物合成mcl-PHA。相關學者投入了大量精力來生產PHA。惡臭假單胞菌是優良的中鏈長度的PHA產生菌株，并且可以利用多種底物，例如脂肪酸。Chinwetkitvanich,S.等人研究溫度和磷限制對活性污泥生物質生產和儲存聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的影響，經過10天發酵，測得混合液中的最大PHA濃度分別為1,491、1,294和1,260mg/L^[4]。因此它無法與較低的成本的石化塑料競爭。通過開發更好的菌株，制定有效的PHA發酵和回收策略，科研人員也為降低PHA生產成本做出了許多努力，因此使用廉價碳源也是當前的熱門話題。

淀粉是一種多羥基聚合物化合物。中國的淀粉產量僅次于美國，其來源廣泛。在整個淀粉生產中，玉米淀粉的比例可以達到90％，馬鈴薯淀粉的比例可以達到7％。近年來，許多研究人員已將淀粉廢水用作碳源并將其與活性污泥混合以生產PHA^[4,5]。

活性污泥厭氧發酵是目前廉價的碳源生產PHA的常用方法，揮發性脂肪酸(Volatile Fatty Acid，簡稱VFA)由乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等小分子揮發性有機酸組成，而厭氧發酵過程中產生的VFA含量比例高。由于VFA組成種類繁多，使得微生物利用其作為碳源時可合成不同碳鏈長度的PHA，因為VFA合成比例組分具有不穩定的特性，因此當微生物使用VFA時，它們無法產生單一的目標PHA類。WF Hu^[6]僅通過調節使用乙酸鈉作為碳源的培養液中加入活性污泥，并通過氣體流量來調節和控制氧化還原電位，發現使用乙酸鈉被用作唯一的碳源時PHA積累為細胞干重為35％(w/w)，說明乙酸可被用作底物合成PHA，且溶氧量在由EAS合成PHBV共聚物中的3HV亞基中起著非常重要的作用，溶氧量的高低直接決定了發酵周期。

傳統活性污泥法合成PHA雖較普遍，但活性污泥發酵周期過長，少則幾周，多則數月，在此發酵過程中，反應釜持續運轉，消耗大量能源。目前也尚未有學者對活性污泥混合菌群進行分離培養，得到高效快速合成PHA的混合菌群。僅僅證明假單胞菌屬為PHA合成優勢菌屬。而且傳統活性污泥合成的PHA為短鏈PHA的混合物，不適用于合成mcl-PHA。

菌群微生物數量越多，代謝過程越復雜，物質轉換效率也會隨之下降。通過人工構建混菌體系，將復雜的生物反應變成簡單的模塊化工作，減少物質多級流動，僅使用幾種微生物構建發酵體系合成mcl-PHA有利于提升mcl-PHA的生產效率。

References: