[發(fā)明專利]一種利用原代肝細胞篩選甲狀腺素受體激動劑的方法

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• 申請日: 2020-06-18
• 公開（公告）號: CN111621546A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設計）人: 徐劍鋒
• 申請（專利權）人: 上海誠益生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12N15/12;C12N15/65;C12N15/861;C12N7/01
• 代理公司: 上海碩力知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 31251
• 代理人: 郭桂峰

本發(fā)明公開了一種利用原代肝細胞篩選甲狀腺素受體激動劑的方法。該方法為：步驟1，構建帶有報告基因和甲狀腺激素反應元件的載體質(zhì)粒TRE?RG；步驟2，將所述載體質(zhì)粒TRE?RG用腺病毒包裝成TRE?luc重組腺病毒，在將此重組腺病毒感染原代肝細胞，加入待測化合物，根據(jù)報告基因的表達產(chǎn)物確定待測化合物是否為甲狀腺素受體激動劑。本發(fā)明創(chuàng)造性地利用原代肝細胞本身高表達甲狀腺素受體，僅需克隆一小段高度保守的甲狀腺素反應元件用于構建報告基因載體，避免了克隆整個甲狀腺素受體或者甲狀腺素受體的配體結(jié)合區(qū)域(LBD)的基因序列的難題，同時可以應用于不同種屬的原代肝細胞，增加了應用靈活性。本發(fā)明方法簡單，感染效率高，克服了現(xiàn)有方法轉(zhuǎn)染效率低，重復性差，實驗穩(wěn)定性差的問題。

技術領域

本發(fā)明屬于藥物篩選技術領域，具體涉及一種利用原代肝細胞篩選甲狀腺素受體激動劑的方法。

背景技術

甲狀腺激素受體(TR,thyroid hormone receptor)激動劑在一系列代謝類疾病中具有很大的治療潛力，其應用領域包括但不限于肥胖、高脂血癥、甲狀腺疾病、酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、肝臟脂肪變性、肝纖維化、高膽固醇血癥、家族性高膽固醇血癥(HeFH/HoFH)、x相關性腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良(X-ALD)、糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、抑郁癥、骨質(zhì)疏松、心律失常、充血性心力衰竭等疾病。但是早期的甲狀腺激素受體激動劑由于在心血管系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)的副作用而阻礙了其臨床開發(fā)。近年來，肝臟靶向性的甲狀腺激素受體激動劑如MGL3196、VK2809等，已經(jīng)在治療NASH和高膽固醇血癥的臨床實驗中證明了甲狀腺激素受體激動劑的有益治療作用，如降低低密度脂蛋白和升高高密度脂蛋白，促進膽固醇向膽汁酸的代謝，降低甘油三酯，同時避免了甲狀腺激素對心臟功能(心動過速、腦卒中體積增加、心臟指數(shù)增加、心肌肥厚、外周血管阻力下降、脈壓升高)和骨骼系統(tǒng)(骨質(zhì)疏松癥)的副作用，證明這種藥物研發(fā)方案是可行的和具有巨大潛力的。因此，篩選具有肝臟選擇性的甲狀腺激素受體激動劑對于這一類藥物的開發(fā)至關重要。

現(xiàn)有技術中對甲狀腺激素受體激動劑的篩選體系主要有HEK293瞬時轉(zhuǎn)染甲狀腺素受體的細胞篩藥體系和HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)甲狀腺素受體的細胞篩藥體系。外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；常規(guī)的病毒法前期準備較復雜、而且可能對細胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法將外源基因如甲狀腺素受體基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293細胞中，利用細胞內(nèi)機制表達甲狀腺素受體。普通的瞬轉(zhuǎn)甲狀腺素受體，通常是轉(zhuǎn)染效率低，重復性差，實驗穩(wěn)定性差，很多細胞系很難成功轉(zhuǎn)染，而且常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑毒性較大，而且轉(zhuǎn)染條件如脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基血清的含量等，都需要通過多次實驗摸索來優(yōu)化和提高轉(zhuǎn)染效率。HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)甲狀腺素受體的細胞體系是在HEK293瞬時轉(zhuǎn)染甲狀腺素受體的細胞體系的基礎上，挑選轉(zhuǎn)染后能穩(wěn)定遺傳甲狀腺素受體基因，并且不會隨著細胞培養(yǎng)代數(shù)增加快速丟失的單細胞，讓其快速增殖以滿足藥物篩選需求的方法。穩(wěn)轉(zhuǎn)甲狀腺素受體系統(tǒng)建立周期長，而且HEK293細胞是一種非肝臟細胞系，如果篩選肝臟選擇性藥物，不能模擬肝臟細胞特異的轉(zhuǎn)運體和代謝功能。

本發(fā)明中縮略語和關鍵術語定義：

TR,throid hormone receptor甲狀腺素受體

TRE,Throid Hormone Responseelements甲狀腺素反應元件

NAFLD，non-alcoholic fatty liver disease，非酒精性脂肪肝病

NASH，Non alcoholic steatohepatitis，非酒精性脂肪肝炎