[發明專利]一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養液的制備方法

在審

• 申請號: 202010553580.2
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111778206A
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 孫紅梅;巴恒星;趙海平;王大濤;劉振
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/077;C12N5/071
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

本發明公開了一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養液的制備方法，屬于組織工程技術領域。本發明解決了現有鹿茸干細胞具有儲存和運輸不便，且存在免疫排斥反應和促進腫瘤細胞轉移和刺激上皮?間質細胞轉化的問題。本發明包括鹿茸干細胞的原代分離培養、傳代培養、條件培養液的收集、保存、處理、凍干等步驟。本發明的方法獲得的鹿茸干細胞條件培養液中含有大量的細胞因子、生長因子、miRNA、mRNAs等多種成分，這些因子可短期或長期參與細胞交流、細胞信號轉導、細胞或組織代謝改變等生理過程，能夠清除DPPH自由基，清除率可達74.63％?82.45％，且對于人角質形成細胞和真皮成纖維細胞增殖具有促進作用。

技術領域

本發明涉及一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養液的制備方法，屬于組織工程技術領域。

背景技術

鹿茸是目前所知的唯一能夠完全再生的哺乳動物器官，且其生長速度可達2cm/d。鹿茸完全再生和快速生長能力主要由于鹿茸干細胞的存在。經鑒定，鹿茸干細胞為介于胚胎干細胞和間充質干細胞之間的一種特殊的干細胞類型。與目前所常用的骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞等干細胞相比，鹿茸干細胞更易于獲取，增殖速度快，分泌大量的細胞因子和生物活性因子。

近年來，利用干細胞移植補充人體干細胞來抗衰老被認為是一項新的有效的措施。骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞、臍帶間充質干細胞等多種干細胞已被證明可以改善機體衰老。然而，直接使用干細胞具有儲存和運輸不便以及免疫排斥方面的缺點。另外，干細胞容易分化成其它基質細胞，可能會促進腫瘤細胞轉移和刺激上皮-間質細胞轉化，存在安全隱患。因此，提供一種能夠將鹿茸干細胞應用于抗皮膚衰老的方法是十分必要的。

發明內容

本發明為了解決現有鹿茸干細胞具有儲存和運輸不便，且存在免疫排斥反應和促進腫瘤細胞轉移和刺激上皮-間質細胞轉化的問題，提供一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養液的制備方法。

本發明的技術方案：

一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養液的制備方法，該方法包括以下步驟：

步驟一，鹿茸干細胞的分離培養；

鹿茸干細胞來源于鹿生茸區骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質組織，采集鹿生茸區骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質組織后置于運輸液中；

步驟二，鹿茸干細胞的原代培養；

(1)將步驟一采集的鹿生茸區骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質組織從運輸液中取出，使用PBS溶液反復清洗直至完全取出血污，然后在一次性無菌平皿中，使用小刀將鹿生茸區骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質組織成切割為0.7mm³的碎塊；

(2)取2-4g碎塊，使用洗滌液洗滌碎塊，然后轉入50mL離心管中，在100rpm的條件下離心5min，棄上清液，收集沉淀；

(3)向(2)獲得的沉淀2-4g中加入20mL消化液，在37℃條件下震蕩進行消化，每間隔10min在顯微鏡下觀察消化情況，在碎塊邊緣出現毛刷樣毛邊時，停止消化，在1000rpm的條件下離心5min，棄上清液，使用DMEM完全培養液洗滌，然后在1000rpm的條件下離心5min，棄上清液，收集沉淀；

(4)取(3)獲得的沉淀0.5-1g，均勻涂在細胞培養瓶底部，倒置培養瓶并加入1-2mL的原代培養液，置于37℃，5％CO₂的細胞培養箱中培養2-4h，然后加入2mL的原代培養液，正置培養瓶繼續靜置培養，2-3天后，開始在顯微鏡下觀察組織塊的貼壁及細胞發散情況，5-7后細胞達到70％匯合，將細胞進行胰蛋白酶消化，凍存，獲得原代鹿茸干細胞；

步驟三，鹿茸干細胞的傳代培養；