[發(fā)明專利]一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202010553580.2 | 申請日： | 2020-06-17 |
| 公開（公告）號： | CN111778206A | 公開（公告）日： | 2020-10-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 孫紅梅;巴恒星;趙海平;王大濤;劉振 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 |
| 主分類號： | C12N5/0775 | 分類號： | C12N5/0775;C12N5/077;C12N5/071 |
| 代理公司： | 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211 | 代理人： | 鄧宇 |
| 地址： | 130112 吉林省長*** | 國省代碼： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 皮膚 衰老 鹿茸 干細胞 條件 培養(yǎng)液 制備 方法 | ||
1.一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
步驟一，鹿茸干細胞的分離培養(yǎng)；
鹿茸干細胞來源于鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質(zhì)組織，采集鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質(zhì)組織后置于運輸液中；
步驟二，鹿茸干細胞的原代培養(yǎng)；
(1)將步驟一采集的鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質(zhì)組織從運輸液中取出，使用PBS溶液反復(fù)清洗直至完全取出血污，然后在一次性無菌平皿中，使用小刀將鹿生茸區(qū)骨膜組織、鹿角柄骨膜組織和鹿茸間充質(zhì)組織成切割為0.7mm3的碎塊；
(2)取2-4g碎塊，使用洗滌液洗滌碎塊，然后轉(zhuǎn)入50mL離心管中，在100rpm的條件下離心5min，棄上清液，收集沉淀；
(3)向(2)獲得的沉淀2-4g中加入20mL消化液，在37℃條件下震蕩進行消化，每間隔10min在顯微鏡下觀察消化情況，在碎塊邊緣出現(xiàn)毛刷樣毛邊時，停止消化，在1000rpm的條件下離心5min，棄上清液，使用DMEA完全培養(yǎng)液洗滌，然后在1000rpm的條件下離心5min，棄上清液，收集沉淀；
(4)取(3)獲得的沉淀0.5-1g，均勻涂在細胞培養(yǎng)瓶底部，倒置培養(yǎng)瓶并加入1-2mL的原代培養(yǎng)液，置于37℃，5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h，然后加入2mL的原代培養(yǎng)液，正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)靜置培養(yǎng)，2-3天后，開始在顯微鏡下觀察組織塊的貼壁及細胞發(fā)散情況，5-7后細胞達到70％匯合，將細胞進行胰蛋白酶消化，凍存，獲得原代鹿茸干細胞；
步驟三，鹿茸干細胞的傳代培養(yǎng)；
將步驟二獲得的原代鹿茸干細胞在傳代培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)，傳至3-5代，鹿茸干細胞生長至70-80％匯合，轉(zhuǎn)至無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集細胞培養(yǎng)上清液，在1000rpm條件下離心，收集上清液，獲得鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液進行真空冷凍干燥，得到鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的活性物凍干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的步驟一中鹿生茸區(qū)骨膜組織采集于鹿生茸區(qū)未開始發(fā)育的1歲齡公鹿的額外嵴生茸區(qū)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的步驟一中鹿角柄骨膜組織采集于2歲齡公鹿的角柄骨膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的步驟一中鹿茸間充質(zhì)組織采集于生長期10-60天的鹿茸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的運輸液為雙倍雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的洗滌液為不含F(xiàn)BS，含雙抗的DMEM培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的消化液為50U/mL的膠原酶Ⅰ。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的原代培養(yǎng)液為含20％FBS，含雙抗的DMEM培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的傳代培養(yǎng)基由含10％FBS，含雙抗的DMEM培養(yǎng)液和mTeSRTM1培養(yǎng)基組成，其中mTeSRTM1培養(yǎng)基所占的質(zhì)量為傳代培養(yǎng)基總質(zhì)量的30％。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗皮膚衰老的鹿茸干細胞條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，所述的無血清培養(yǎng)基由DMEM完全培養(yǎng)基和mTeSRTM1培養(yǎng)基組成，其中mTeSRTM1培養(yǎng)基所占的質(zhì)量為無血清培養(yǎng)基總質(zhì)量的30％。
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