[發明專利]微流控過濾芯片、基于AuNPs的核酸三重檢測試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202010553492.2
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN113005002A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 韓琳;高亞坤;張宇
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12M1/36;C12M1/34;C12M1/12;B01L3/00
• 代理公司: 青島華慧澤專利代理事務所(普通合伙) 37247
• 代理人: 馬千會

本發明屬于核酸檢測技術領域，涉及用于核酸檢測的微流控芯片、試劑盒及方法。微流控過濾芯片，該芯片從上到下依次包括加樣層、過濾層、檢測層；其中，所述加樣層上設有第一微腔；所述過濾層上與所述第一微腔對應的位置設有過濾膜；所述檢測層上與所述過濾膜對應的位置設有第二微腔；進入所述第一微腔中的混合物在驅動力的作用下經過所述過濾膜進入所述第二微腔中，實現固液分離。本發明通過將比色反應后的AuNPs溶液利用該芯片進行過濾分離，隨著miRNA濃度的升高，形成的雙鏈增加，吸附在AuNPs表面的DNA探針減少，停留在濾膜上與DNA探針結合的熒光基團的拉曼光譜強度降低；溶液中游離的雙鏈的熒光強度也會越來越高，結合比色結果，進行三重驗證，提高檢測的準確性。

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，涉及用于核酸檢測的微流控芯片、試劑盒及方法。

背景技術

近年來，研究者們陸續發現miRNA在癌癥早期表達發生異常，作為一種新型的腫瘤標志物受到越來越多的關注。傳統的miRNA檢測手段例如Northern blot，PCR和微陣列等。這些方法需要轉錄和擴增，檢測步驟繁瑣，費時且費力。

為了對miRNA進行絕對或相對定量檢測，現有技術中已經通過使用比色法、熒光、SERS，電化學和表面等離振子共振作為檢測平臺，開發了許多新穎的傳感方法。其中，比色法簡單，成本低，易于操作并且可以直觀地監視信號變化，因此備受關注。由于AuNPs聚集時其可見的顏色變化，獨特的光學特性和高比表面積，因此被廣泛用于比色傳感器的制備。當該傳感器用于核酸檢測時，DNA跟AuNPs依靠正負電荷吸附原理被吸附在AuNPs表面，可以使AuNPs抵抗鹽誘導的聚集。在存在miRNA的情況下，DNA探針往往會與miRNA雜交形成雙鏈。雙鏈剛性結構構象使它們與AuNPs保持一定距離，致使脫離DNA保護的AuNPs在鹽溶液中被誘導聚集。因此AuNPs的吸光度依賴于miRNA濃度而變化。

然而，實際檢測樣本的組成成分很復雜，不同的物質都有可能誘導AuNPs吸光度發生變化，導致檢測結果的準確性不高。為了對miRNA進行更加準確的定量檢測，需要排除一些干擾物質的影響。

現有技術中，關于提高AuNPs比色法檢測準確性的相關措施和解決手段鮮有報道。因此，如何解決AuNPs比色法對miRNA定量檢測的準確性問題是需要關注的焦點。

發明內容

本發明的目的是解決現有AuNPs比色法檢測準確性不高的問題，提供一種基于AuNPs的miRNA三重檢測微流控芯片、試劑盒和方法。本發明通過將比色反應之后的AuNPs溶液利用該芯片進行過濾分離，停留在濾膜上的AuNPs，因為具有拉曼增強效果，可以對吸附在其表面的DNA分子的熒光基團進行拉曼檢測。隨著miRNA濃度的升高，形成的雙鏈增加，吸附在AuNPs表面的DNA也會減少，停留在濾膜上與DNA探針結合的熒光基團的拉曼光譜強度也會降低；溶液中游離的雙鏈隨著miRNA濃度的升高而升高，熒光強度也會越來越高，結合比色結果，進行三重驗證，提高檢測的準確性。

為了解決本發明的技術問題，本發明首先采用的技術方案是提供一種微流控過濾芯片，該芯片從上到下依次包括加樣層、過濾層、檢測層；其中，所述加樣層上設有第一微腔；所述過濾層上與所述第一微腔對應的位置設有過濾膜；所述檢測層上與所述過濾膜對應的位置設有第二微腔；進入所述第一微腔中的混合物在驅動力的作用下經過所述過濾膜進入所述第二微腔中，實現固液分離；所述的基底層上修飾多聚賴氨酸。

作為本發明的一種優選方式，所述的過濾膜為納米孔徑的過濾膜。

作為本發明的一種優選方式，所述的檢測層上設有第三微腔，所述第三微腔通過微流道與所述第二微腔連接。

進一步優選地，所述的加樣層上方設有抽吸層，所述抽吸層與所述第三微腔連接，用于傳遞負壓抽吸力。

作為本發明的一種優選方式，所述的檢測層下方設有多聚賴氨酸襯底。