[發明專利]去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法

在審

• 申請號: 202010551950.9
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111705040A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 鄭良益;漆世華;石寶蘭;朱薇;舒銀輝;謝紅玲;李晶梅;徐松;王治江;李婷婷
• 申請（專利權）人: 國藥集團動物保健股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 艾小倩

本發明公開了一種去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，具體操作為：取已污染支原體的偽狂犬病種毒，接種小鼠腦部，接種后48h～72h，取發病死亡小鼠腦組織無菌研磨后，分離偽狂犬病病毒，在適宜細胞上用蝕斑試驗進行病毒純化，挑選約0.5mm蝕斑5～8個接種適宜單層細胞進行培養，將收獲的病毒液進行鑒別檢驗、病毒含量檢驗、支原體檢驗，確認獲得的病毒為偽狂犬病病毒，病毒含量≥10^8.0TCID₅₀/ml，無支原體污染。本發明可以有效去除偽狂犬病病毒液中的支原體，經各項檢驗，純化后的偽狂犬病病毒培養滴度高、安全和免疫原性均良好。

技術領域

本發明屬于獸用生物制品領域，具體涉及一種去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法。

技術背景

豬偽狂犬病(PR)是由豬偽狂犬病病毒引起的一種急性傳染病，其主要臨床特征為成年豬呈隱性感染，妊娠母豬發生流產、死胎及呼吸道癥狀。低日齡仔豬感染后常出現發熱、拉稀，并伴隨明顯的神經癥狀和呼吸困難。本病在豬群中傳播快、仔豬死亡率高，是豬場面臨的重大傳染病之一。我國是偽狂犬病流行廣泛的國家，目前已有多個省(市、區)報道本病發生，已經造成巨大的經濟損失。在偽狂犬病防制中，疫苗起著重要作用。

支原體又稱霉形體，是介于細菌和病毒之間的一種原核生物，大小約0.2～0.3μm。在《中國獸藥典》中有明文規定，疫苗制品中應無支原體污染。而控制疫苗中的支原體污染，最關鍵的是從源頭控制，制備疫苗的種毒絕不允許有支原體，如種毒存在支原體，那么會影響后期的生產毒種、疫苗抗原，會導致成品疫苗支原體污染，浪費生產成本，造成極為嚴重的后果。因此，去除疫苗種毒中的支原體是極其重要的，也是偽狂犬疫苗生產企業及科研人員極力解決的關鍵問題。

我們目前所知道的去除支原體的方法一般為物理的過濾方法，即采用0.1μm和0.22μm的濾膜過濾，來去除病毒液中的支原體。但偽狂犬病病毒粒子為100～150納米，采用太小的濾膜過濾時，會導致病毒粒子也被過濾掉，而采用孔徑稍大的濾膜又不能有效過濾掉支原體，效果也是差強人意，不具有實際應用的價值。

因此，為保證偽狂犬病病毒液、毒種不被支原體污染，從而確保疫苗質量，發明一種去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法顯得刻不容緩。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法。

為實現上述目的，本發明提供的一種去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)小鼠接種：在隔離飼養的清潔級小鼠腦部注射偽狂犬病疫苗種毒，接種后48h～72h，取發病死亡小鼠腦組織無菌研磨，分離偽狂犬病病毒；

(2)用細胞維持液將分離的偽狂犬病病毒液稀釋，接種4個已長成細胞單層的平皿；經37℃培養箱培養1小時后，加入44℃營養瓊脂，每個平皿10ml，置于含5％二氧化碳培養箱內培養；48小時后加入含0.01％中性紅5ml覆蓋，繼續培養24～48小時后，選取產生空斑的平皿，選擇小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml營養液的離心管中，經凍融后以3000r/min離心10分鐘，取上清按上述方法再次進行克隆1次；

(3)病毒純化第2次時，挑選直徑約0.5mm蝕斑，按1％V/V接種已成長單層的健康細胞，置37℃、含5％CO₂培養箱中培養并觀察2～3日，當75％以上細胞出現病變時收獲，置-40℃以下凍融若干次，取樣鑒定；

(4)純化病毒進行如下檢驗：

①用陽性血清中和試驗法進行鑒別檢驗，病毒對照孔應出現CPE，正常細胞對照孔和病毒中和孔均應不產生CPE；

②進行病毒含量檢驗，每毫升病毒含量應≥10^7.0TCID₅₀；