[發明專利]去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法

在審

• 申請號: 202010551950.9
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111705040A
• 公開（公告）日: 2020-09-25
• 發明（設計）人: 鄭良益;漆世華;石寶蘭;朱薇;舒銀輝;謝紅玲;李晶梅;徐松;王治江;李婷婷
• 申請（專利權）人: 國藥集團動物保健股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/02
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 艾小倩

1.一種去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)小鼠接種：在隔離飼養的清潔級小鼠腦部注射偽狂犬病疫苗種毒，接種后48h～72h，取發病死亡小鼠腦組織無菌研磨，分離偽狂犬病病毒；

(2)用細胞維持液將分離的偽狂犬病病毒液稀釋，接種4個已長成細胞單層的平皿；經37℃培養箱培養1小時后，加入44℃營養瓊脂，每個平皿10ml，置于含5％二氧化碳培養箱內培養；48小時后加入含0.01％中性紅5ml覆蓋，繼續培養24～48小時后，選取產生空斑的平皿，選擇小而孤立的空斑挑出，加入含0.5ml營養液的離心管中，經凍融后以3000r/min離心10分鐘，取上清按上述方法再次進行克隆1次；

(3)病毒純化第2次時，挑選直徑約0.5mm蝕斑，按1％V/V接種已成長單層的健康細胞，置37℃、含5％CO₂培養箱中培養并觀察2～3日，當75％以上細胞出現病變時收獲，置-40℃以下凍融若干次，取樣鑒定；

(4)純化病毒進行如下檢驗：

①用陽性血清中和試驗法進行鑒別檢驗，病毒對照孔應出現CPE，正常細胞對照孔和病毒中和孔均應不產生CPE；

②進行病毒含量檢驗，每毫升病毒含量應≥10^7.0TCID₅₀；

③按現行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗，符合規定。

2.根據權利要求1所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的清潔級小鼠為體重16～22g昆明小鼠。

3.根據權利要求1或2所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的偽狂犬病種毒的病毒含量為10^6.5～10^7.5TCID₅₀/ml。

4.根據權利要求1或2所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的小鼠的注射劑量為0.02ml～0.05ml/只。

5.根據權利要求3所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的小鼠的注射劑量為0.02ml～0.05ml/只。

6.根據權利要求1或2或5所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的偽狂犬病病毒液稀釋的病毒含量為10TCID₅₀～50TCID₅₀。

7.根據權利要求1或2或5所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(2)和步驟(3)中的培養偽狂犬病病毒的細胞為豬睪丸細胞、BHK-21細胞、Vero細胞或雞胚成纖維細胞中任一種。

8.根據權利要求1或2或5所述的去除偽狂犬病病毒液中支原體的方法，其特征在于：所述步驟(3)中病毒接種比例V/V為1～3％，凍融次數為1～2次。