[發明專利]一種基于核心基因組SNP分析的副溶血性弧菌溯源方法

在審

• 申請號: 202010551662.3
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111724859A
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發明（設計）人: 龐銳;吳清平;吳詩;張菊梅;黎艷萍;雷濤;陳謀通;張淑紅;楊小鵑;葉青華
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）
• 主分類號: G16B30/00
• 分類號: G16B30/00;G16B50/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

本發明公開了一種基于核心基因組SNP分析的副溶血性弧菌溯源方法，所述方法對研究樣品菌株和參考菌株核心基因組的SNP進行分析，判斷其與各參考菌株之間的雙尾SNP距離，可得到樣品菌株與參考菌株之間的溯源關系，并可進一步用于樣品菌致病性研究。本發明的副溶血性弧菌菌株溯源方法，可精確地反映樣品菌與已知參考菌之間的分化時間，能較好地解釋不同菌株之間的克隆性。相對于傳統的分型方法，本發明方法通量更高，分辨率、準確性和重復性都更好，有助于確定不同菌株之間是否存在直接傳播關系，對于不同菌株的流行病學關聯研究、疾病防控具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于生物信息領域，涉及一種基于核心基因組SNP分析的副溶血性弧菌溯源方法。

背景技術

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是革蘭氏陰性、嗜鹽性細菌，是我國一種重要的食源性致病細菌，廣泛存在于海水，咸水湖及海產品中，能夠感染蝦、蟹、牡蠣、各種貝類等各種水產經濟動物，引起魚類皮膚潰瘍、蝦紅體病等弧菌病，威脅海洋漁業和水產養殖業的發展。同時，人們食用了攜帶致病性副溶血性弧菌的食物往往會造成急性胃腸炎，其主要癥狀有惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛及低燒，嚴重者可導致敗血癥。在該菌所致的食源性疾病暴發事件中，能否及時、準確追溯其潛在污染源，是采取有效的控制和預警措施的關鍵。目前對該菌的溯源主要采取分子分型技術，包括脈沖場凝膠電泳分析(pulsed-field gelelectrophoresis，PFGE)、共有重復序列PCR(Entero-bacterial repetitive intergenicconsersisi-PCR，ERIC-PCR)、多位點序列分型(Multilocus sequence typing，MLST)等。

已有的分子分型技術均存在一定程度的局限性，比如PFGE實驗操作復雜、耗時長，實驗數據只能用于菌株的相似性比對，不能解釋不同菌株之間的克隆性；MLST基于有限的7個管家基因位點，分辨力低，對不同暴發或者沒有直接流行病學關聯的菌株區分能力差。而且目前所有的分子分型技術均不能很好地解決分辨率低的問題。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的是提供一種高分辨率、準確性高、重復性好的高通量的分型技術。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種副溶血性弧菌溯源方法，包括如下步驟：

(1)全基因組測序：構建樣品副溶血性弧菌基因組文庫并進行全基因組測序和組裝，得到樣品副溶血性弧菌全基因組序列；

(2)核心基因組SNP分析：以包括RIMD2210633參考菌株的已知副溶血性弧菌的基因組序列作為參考基因組集，對樣品菌株核心基因組SNP進行分析；

(3)過濾重組區域及系統發育分析：預測并過濾副溶血性弧菌菌株基因組上潛在的重組區域，過濾后的對齊序列進行系統發育分析、構建進化樹；

(4)進化樹可視化及溯源分析：將分析結果可視化，根據樣品菌株與參考菌株之間的雙尾SNP距離進行溯源分析。

核心基因組單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)普遍存在于機體DNA序列中，是第三代遺傳標記，通過檢測待測菌的特定SNP位點上的堿基類型即可鑒別出待測的分枝桿菌的種類。本發明以RIMD2210633序列為標準參考序列，從而確定不同菌株的SNP位點。

以不同的已知副溶血性弧菌菌株基因組數據為參考基因組集，可以得到不同的分析結果；此處不同的分析結果指含有的不同菌之間的比較結果的有無，而非同樣的兩種菌之間相關性結果的不同。參考菌株的公開數據可從NCBI等網站的公開數據庫中得到。所述雙尾SNP距離(pair-wise SNP distance)，指兩兩菌株之間的SNP距離。