[發明專利]一種人源iPS分化的心肌細胞用的新型3D培養基及其配制方法和應用

在審

• 申請號: 202010551026.0
• 申請日: 2020-06-17
• 公開（公告）號: CN111690596A
• 公開（公告）日: 2020-09-22
• 發明（設計）人: 林彬;高強;岑堅正;莊建;林澤斌;林先明;周麗詩
• 申請（專利權）人: 廣東源心再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/071
• 代理公司: 佛山幫專知識產權代理事務所(普通合伙) 44387
• 代理人: 曾鳳云

本發明公開了一種人源iPS分化的心肌細胞用的新型3D培養基及其配制方法和應用，每300μL的培養基中包括纖維蛋白原90?150μL、抑肽酶15?25μL、基質膠60?100μL、凝血酶10μL、殼聚糖濃度為1?3％，余量為心肌細胞培養液；心肌細胞培養液由RPMI 1640培養液加入終體積濃度為3％的KnockOut^TM血清替代物配制而成。該新型3D培養基可為心肌細胞提供生物支架，提供充足的生長空間和支持細胞間聯系的空間結構，更有利于形成細胞片，首次將殼聚糖、Matrigel同時加入制成新的纖維蛋白凝膠；外觀上與普通凝膠相同，但培養的細胞活性更高，證明加入殼聚糖、Matrigel可有效提升質量。

技術領域

本發明涉及一種人源iPS分化的心肌細胞用的新型3D培養基及其配制方法和應用。

背景技術

誘導多能干細胞(iPSCs)是2007年日本學家山中伸彌通過重編程技術獲得的一種具有和胚胎干細胞(ES)相似的全能性能力的干細胞。目前人源iPS已成功分化成各種組織細胞，利用其培育出軟骨、腎小管、心臟組織等組織器官。這種技術可避免倫理問題，能夠培養出自體的心肌細胞，為各種心血管疾病治療、藥物開發提供研究平臺。

心肌細胞體外培養一般是在傳統的培養皿上進行，在這種二維環境下培養不能良好的模擬人體微環境，導致細胞在結構和功能上發生一系列適應性改變，影響后續檢測結果。三維培養體系下培養的心肌細胞能更為準確地體現成熟心肌細胞的生理特性，既能為心血管藥物的篩選、心血管疾病的研究提供實驗模型，也可為組織再造、細胞移植等提供成熟的生物材料。

三維培養支架為細胞粘附、散布、遷移、增殖、分化提供結構支持，是組織工程技術的關鍵，要在體外培養出理想的心肌細胞，就必須制備出一種生物相容性良好，機械性能適宜的，并具備特定微觀結構的支架材料。目前用于心肌細胞培養的支架普遍存在難以為細胞提供理想的細胞外微環境、保證細胞活性和功能性，制備困難、價格高昂等問題。

發明內容

有鑒于此，本發明所要解決的技術問題，就是提出一種人源iPS分化的心肌細胞用的新型3D培養基，具有可塑性、生物相容性良好的特點，此外，本發明還提出了該新型心肌細胞3D培養基的制備方法和應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現：

一種人源iPS分化的心肌細胞用的新型3D培養基，每300μL的培養基中包括纖維蛋白原90-150μL、抑肽酶15-25μL、基質膠60-100μL、凝血酶10μL、殼聚糖濃度為1-3％，余量為心肌細胞培養液；

其中，所述心肌細胞培養液是由RPMI 1640培養液加入終體積濃度為3％的KnockOut^TM血清替代物配制而成。

進一步地，每300μL新型3D培養基中包括纖維蛋白原120μL、抑肽酶20μL、基質膠80μL、凝血酶10μL、殼聚糖濃度為2.0％。

進一步地，所述纖維蛋白原的工作濃度為50-100mg/ml，抑肽酶的工作濃度為50-100mg/ml，凝血酶的工作濃度為1000U/ml，三者都是用PBS緩沖液配制而成。

殼聚糖是一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性，并且具有可降解、低免疫原性的特點。但不溶于水，溶于稀酸，因此不能單獨使用于細胞培養中，必須通過其他試劑稀釋或中和其酸性。

基質膠(Matrigel)可形成具有生物學活性的三維基質，模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養和分化。使用方式有薄層凝膠法和厚層凝膠法。在單獨使用時無論使用哪種方式，細胞僅生長在膠表面或因重力沉積在底部生長，無法充分達到三維培養的效果。