[發(fā)明專利]促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010549738.9
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111686305B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設計）人: 蘆慧穎;李婷婷;張怡;劉艷青
• 申請（專利權）人: 天晴干細胞股份有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/22;A61L27/02;A61L27/50;A61L27/52;A61L27/54;C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 李紅媛

促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，它涉及干細胞領域。它用于軟骨損傷和骨缺損的修復。方法：一、sPL的制備；二、間充質干細胞趨向分化；三、凝膠組合物的制備。本發(fā)明制備出sPL后對所含生長因子含量進行檢測，再調節(jié)生長因子濃度，保證PL的均一性。進行治療前，先對間充質干細胞進行趨向分化，使干細胞向治療所需要的方向分化，這樣可以有效縮短治療周期，加速修復、填補損傷部位所需種類細胞。可使細胞繼續(xù)分化，提高治療效果，節(jié)約治療成本?？捎糜谥委煿侨睋p、骨不連、骨損傷，可促進骨的愈合與再生。對軟骨損傷和骨缺損修復有顯著效果，軟骨表面趨于平滑，缺損部位骨全部修復。本發(fā)明應用于軟骨損傷和骨缺損的修復。

技術領域

本發(fā)明屬于干細胞領域，具體涉及促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法。

背景技術

PL(血小板裂解液)來源于自體血液，具有無疾病傳染及免疫排斥等優(yōu)點，且取材方便、制備簡便、費用合理、手術時間短等優(yōu)勢，自發(fā)現以來已逐漸應用于口腔、整形、骨科、耳鼻喉科、神經外科等領域的組織修復中，已有大量的試驗數據證明其在骨損傷修復的作用。Assoian首先發(fā)現了血漿中提取的PRP(濃縮血小板血漿)中含有多種生長因子,為骨缺損的修復提供了廣泛的應用前景。PL具有促進移植骨成活和再生的能力；可使骨形成速度增加2倍，骨密度增加20％；可使種植牙早期獲得固位成功，促進皮膚和黏膜組織的創(chuàng)傷愈合，無抗原抗體的免疫反應，感染的危險性小。

PL復合技術是近年研究的熱點，復合的細胞是一類具有自我復制更新且具分化潛力的細胞。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是成體干細胞的一種，來自胚胎發(fā)育的過程中，MSCs擔負者向骨、軟骨、脂肪、肌腱韌帶等的發(fā)育分化功能。研究體外擴增的MSCs向軟骨分化和軟骨損傷的研究可以追溯到上個世紀八、九十年代。Oshton(1980)、Nuttall(1998)等分別以動物骨髓MSCs或人骨髓MSCs體外試驗證實了其具有分化為骨、軟骨、纖維組織的能力，Davis等有從單細胞克隆角度，證實了同一細胞來源的MSCs可以分別分化為骨和軟骨，從而進一步確立了MSCs的多向分化潛能。

PL復合間充質干細胞技術在大量的動物模型試驗已經表明在骨損傷治療中的具有效果，但是，治療的效果、均一性，損傷恢復時間，PL的濃縮率不確定及釋放生長因子量不穩(wěn)定，間充質干細胞是否在損傷環(huán)境中，定向分化成所需填充的細胞或分泌所需要的因子。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的是提供促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，用于軟骨損傷和骨缺損的修復。

促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，它按以下步驟實現：

一、超活性多細胞因子制劑(sPL)的制備：

a、枸櫞酸鈉抗凝管無菌采集新鮮人血液10～20ml，200g/min離心15min，收集血漿于濃縮管中，200g/min離心15min，收集上清，獲得濃縮的血小板血漿，于-80℃保存至少24h；

b、取上述-80℃下保存的濃縮的血小板血漿，4℃融化，渦旋混合儀震蕩5s，1000r/min離心3min，收集上清后采用0.22μm濾膜進行過濾，獲得sPL；

二、間充質干細胞趨向分化：

c、培養(yǎng)完成的間充質干細胞進行成骨細胞趨向分化：按照1×10⁴/ml密度將培養(yǎng)完成的間充質干細胞接種在成骨細胞趨向分化培養(yǎng)基中，第二天換液，以后每三天換液一次，培養(yǎng)3～5天，收集有趨向分化的成骨細胞，計數，凍存，備用；

d、培養(yǎng)完成的間充質干細胞進行軟骨細胞趨向分化：按照5×10⁵/ml密度將培養(yǎng)完成的間充質干細胞接種在成軟骨細胞趨向分化培養(yǎng)基中，第二天換液，每三天換液一次，培養(yǎng)3-5天，收集有趨向分化的軟骨細胞，計數，凍存，備用；

三、凝膠組合物的制備：