[發明專利]促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法

有效

• 申請號: 202010549738.9
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111686305B
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 蘆慧穎;李婷婷;張怡;劉艷青
• 申請（專利權）人: 天晴干細胞股份有限公司
• 主分類號: A61L27/36
• 分類號: A61L27/36;A61L27/38;A61L27/22;A61L27/02;A61L27/50;A61L27/52;A61L27/54;C12N5/077;C12N5/0775
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 李紅媛

1.促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，其特征在于它按以下步驟實現：

一、超活性多細胞因子制劑的制備：

a、枸櫞酸鈉抗凝管無菌采集新鮮人血液10～20mL，200g/min離心15min，收集血漿于濃縮管中，200g/min離心15min，收集上清，獲得濃縮的血小板血漿，于-80℃保存至少24h；

b、取上述-80℃下保存的濃縮的血小板血漿，4℃下融化，渦旋混合儀震蕩5s，1000r/min離心3min，收集上清后采用0.22μm濾膜進行過濾，獲得超活性多細胞因子制劑；

二、間充質干細胞趨向分化：

c、培養完成的間充質干細胞進行成骨細胞趨向分化：按照1×10⁴/mL密度將培養完成的間充質干細胞接種在成骨細胞趨向分化培養基中，第二天換液，以后每三天換液一次，培養3～5天，收集有趨向分化的成骨細胞，計數，凍存，備用；所述成骨細胞趨向分化培養基的成分：在含10％FBS的α-MEM中加入50μM/mL抗壞血酸、10mm/mLβ-磷酸甘油和100nm/mL地塞米松；

d、培養完成的間充質干細胞進行軟骨細胞趨向分化：按照5×10⁵/mL密度將培養完成的間充質干細胞接種在成軟骨細胞趨向分化培養基中，第二天換液，每三天換液一次，培養3-5天，收集有趨向分化的軟骨細胞，計數，凍存，備用；所述成軟骨細胞趨向分化培養基的成分：在α-MEM中加入1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/L左旋維生素C、0.1nmol/L地塞米松、10ng/mL TGF-beta 3、6.25μ/mL重組人胰島素、6.25μg/mL轉鐵蛋白、6.25ng/mL亞硒酸、1.25ng/mL牛血清白蛋白、5.35μg/mL亞油酸；

三、凝膠組合物的制備：

e、采用步驟b中所得超活性多細胞因子制劑重懸步驟c中所得有趨向分化的成骨細胞或步驟d中所得有趨向分化的軟骨細胞，重懸液的密度為(0.5～1)×10⁶/mL，然后加入成骨治療趨化因子或軟骨治療趨化因子，混勻，獲得含有成骨趨向分化細胞的超活性多細胞因子溶液或含有軟骨趨向分化細胞的超活性多細胞因子溶液；所述成骨治療趨化因子由抗壞血酸、β-磷酸甘油和地塞米松組成；所述軟骨治療趨化因子由丙酮酸鈉、左旋維生素C、地塞米松、TGF-beta 3、重組人胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、牛血清白蛋白和亞油酸組成；

f、采用10％CaCl₂溶液配制濃度為100～200U/mL的凝血酶溶液；

g、將步驟e中所得含有成骨趨向分化細胞的超活性多細胞因子溶液或含有軟骨趨向分化細胞的超活性多細胞因子溶液與凝血酶溶液按體積比1:1混勻，50～70s后形成凝膠，即完成促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備。

2.根據權利要求1所述的促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，其特征在于步驟c和d中所述培養的溫度均為37℃。

3.根據權利要求1所述的促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，其特征在于步驟g中每1mL的促進骨愈合與再生的凝膠組合物中含有50～100μmol抗壞血酸、10～50mmolβ-磷酸甘油和100～200nmol地塞米松。

4.根據權利要求1所述的促進骨愈合與再生的凝膠組合物的制備方法，其特征在于步驟g中每1mL的促進骨愈合與再生的凝膠組合物中含有1～5μmol丙酮酸鈉、0.1～0.5μmol左旋維生素C、0.1～0.5pmol地塞米松、10～50ng TGF-beta 3、5～10U重組人胰島素、5～10μg轉鐵蛋白、5～10ng亞硒酸、1～5ng牛血清白蛋白和3～8μg亞油酸。