[發(fā)明專利]一種秸稈降解菌分離、篩選、鑒定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010548006.8
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111748476A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李忠和;欒立明;楊曉東;高星愛;孫旭;李明;王海文
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林工程技術(shù)師范學(xué)院
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/04;C12Q1/34;C12Q1/6869
• 代理公司: 長沙智德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43207
• 代理人: 段芳萼

1.一種秸稈降解菌分離、篩選、鑒定方法，其特征在于，包括如下具體步驟：

S1：將得到的秸稈降解菌菌株轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上，經(jīng)多代分離轉(zhuǎn)接后獲取幾組生長較塊的微生物群落，即為初篩菌株；

S2：測定水解圈和纖維素酶活性，具體為：

S21：水解圈測定：將上述得到的幾組初篩菌株接種到CMC-Na培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7-9d后，用0.2%的剛果紅水溶液浸染10-12min，倒掉液體，再用1 mol/L的NaCl水溶液脫色10-12min，測量各組菌株的水解圈直徑D和菌落直徑d，根據(jù)公式Dp=(D/d)計算菌株的水解能力Dp；

S22：纖維素酶活性測定：

S221：還原糖含量的測定：利用DNS法比色法測定秸稈降解后的多糖產(chǎn)量，并利用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S222：計算纖維素酶活性；

S3：測定秸稈降解率：

S31：將新鮮的玉米秸稈剪成5-8cm的小段，添加到秸稈液體培養(yǎng)基，制成秸稈降解培養(yǎng)基；

S32：用初篩菌株制備成菌懸液，在每瓶秸稈降解培養(yǎng)基中加入5%的菌懸液以用于接種，在28℃-30℃的溫度條件下發(fā)酵10-15d后，將秸稈取出，用蒸餾水洗滌2-3次，去除秸稈上附著的菌體和沉淀物，并烘干至恒定重量；

S33：對秸稈降解率進(jìn)行測算；

S4：根據(jù)S2、S3中的測定結(jié)果篩選出水解能力強(qiáng)、纖維素酶活性高、秸稈降解率高的菌劑；

S5：將上述篩選得到的菌劑進(jìn)行鑒定：

S51：采用宏基因組測序試驗對菌劑中的微生物群體進(jìn)行高通量測序；

S52：Fragment DNA：在Covaris tube中加入52.5ul 1ug DNA樣品，轉(zhuǎn)移50ul片段化的DNA到新的PCR板中，清理碎片 DNA，加入80ul；磁力架上放置至上清透明，去上清液；將平板一直置于磁力架上，加入200ul新鮮配制的80%的乙醇；室溫30s棄去上清液，并放置5min，氣干，從磁力架上取下平板，加入62.5ul懸浮緩沖液，吹打10次，充分混勻，室溫2min，置于磁力架上2-5min至上清液透明，轉(zhuǎn)移60ul至新的PCR管中；在60ul片段化的DNA中加入40ulERP2 or ERP3，吹打10次，混勻至PCR儀上，30℃溫度條件下處理 30min；分選片段，插入大小為350bp的稀釋SPB；

S53：16SrDNA序列測定與系統(tǒng)學(xué)分析：

S531：在每20LPCR產(chǎn)物中加入2ul3M的NaAc和50ul100%酒精；

S532：使用臺式離心機(jī)在4℃的條件下離心30min，離心完成后馬上對上清液進(jìn)行去除；

S533：加入70ul70%酒精，使用臺式離心機(jī)在4℃的條件下離心15min，離心完成后馬上對上清液進(jìn)行去除；

S534：在室溫條件下，讓酒精揮發(fā)干凈，并加入10ul去離子水使DNA溶解。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種秸稈降解菌分離、篩選、鑒定方法，其特征在于：步驟S222中，纖維素酶活性的計算方法為：

纖維素酶活性（U/ml）=（m×1000×n）/（M×V×t），式中：

m：反應(yīng)過程中產(chǎn)生葡萄糖的量（mg）；

n：粗酶液稀釋倍數(shù)；

M：葡萄糖分子質(zhì)量（μg /μmol）；

V：反應(yīng)體系中粗酶液的體積（ml）；

t：反應(yīng)時間（min）。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種秸稈降解菌分離、篩選、鑒定方法，其特征在于：步驟S33中，秸稈降解率的測算公式為：

秸稈降解率%=（W₀-W_t）/W₀×100%，式中：

W₀：樣品秸稈的干重；

W_t：培養(yǎng)t時間后秸稈干重。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種秸稈降解菌分離、篩選、鑒定方法，其特征在于：步驟S51中，宏基因組測序詳細(xì)建庫流程為：基因組DNA-片段化-文庫構(gòu)建-橋式PCR-Illumina測序。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種秸稈降解菌分離、篩選、鑒定方法，其特征在于，S53中，菌種鑒定所采用引物為7F1540R（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT AGGAGGTGAT CCAGCCGCA-3’），PCR長度為1500bp，PCR產(chǎn)物的純度為OD260/OD280=1.6-2.0，用量為每反應(yīng)10-100ng。