[發明專利]一種快速測定發酵液中透明質酸含量的方法

有效

• 申請號: 202010547909.4
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111551513B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;石艷麗;陳玉娟;穆淑娥;郭學平;欒貽宏;周寧;魏玉潔;孫元軍
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 賈波

本發明公開了一種快速測定發酵液中透明質酸含量的方法，該方法將發酵液進行吸附純化，將吸附純化后的上清液稀釋后進行酶解，使發酵液中的透明質酸徹底酶解為4,5?不飽和雙糖，然后檢測酶解前后發酵液的紫外吸收值，將酶解前后發酵液紫外吸收值的差值帶入4,5?不飽和雙糖濃度與紫外吸收值的標準曲線中，計算得到發酵液中透明質酸的含量。該方法操作簡便，專一性高，無需對發酵液中的透明質酸進行純化，批次檢測樣品數量多，可以廣泛應用于透明質酸發酵領域中對透明質酸含量的檢測，為透明質酸發酵工藝的優化與過程監控提供了便捷高效的工具。

技術領域

本發明涉及一種快速測定發酵液中透明質酸含量的方法，特別是涉及一種利用透明質酸酶或硫酸軟骨素酶對透明質酸發酵液進行徹底酶解，并利用酶解前后發酵液在232nm處的吸收值差值來標定發酵液中透明質酸含量的檢測方法，屬于酶學及藥物化學技術領域。

背景技術

透明質酸是一種廣泛存在于動物及人體內的天然粘多糖，是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸雙糖重復單位通過β-(1→4)糖苷鍵和β-(1→3)糖苷鍵構成的無分支高分子糖胺聚糖。幾乎所有的動物組織中均含有?HA，含量較高能夠用于工業生產原料的主要為雞冠和人臍帶。隨著HA用途越來越廣泛，而動物來源的原料有限，提取法已經越來越無法滿足工業化生產的需要。細菌發酵法是利用某些以?HA?為主要成分的莢膜的鏈球菌，通過對菌株篩選、誘變，優化發酵條件制備HA，極大程度上提高了HA的產量，降低了生產成本。

經典的透明質酸含量檢測方法為硫酸咔唑法，咔唑顯色法檢測透明質酸被認為是最為廣泛的方法，目前藥典中檢測透明質酸均是采用該方法，但咔唑顯色法的特異性差，透明質酸發酵液中的成分比較復雜，直接用發酵液進行咔唑顯色檢測干擾因素太多，特別是發酵工藝開發初期，采用不同培養基發酵出來的透明質酸發酵液性質差別比較大，勢必會影響判斷。因此需要預先對透明質酸發酵液進行醇沉、重溶后，才能進一步利用咔唑法測定透明質酸含量，操作復雜。

發明內容

針對現有透明質酸檢測方法存在的不足，本發明提供了一種快速測定發酵液中透明質酸含量的方法，該方法利用透明質酸裂解酶（hyaluronate?lyase）或硫酸軟骨素酶酶解透明質酸得到的4,5-不飽和雙糖在紫外區有特異性吸收峰的特性，通過透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶酶解-紫外檢測酶解液的思路檢測發酵液中透明質酸的含量，該方法操作簡便、專一性高、檢測快速，無需對發酵液中的透明質酸進行純化，批次檢測樣品數量多，適合各種培養基得到的透明質酸發酵液，可以廣泛應用于透明質酸發酵領域中對透明質酸含量的檢測，為透明質酸發酵工藝的優化與過程監控提供了便捷高效的工具。

透明質酸裂解酶（hyaluronate?lyase）或硫酸軟骨素酶是作用于β-1,4糖苷鍵、能夠通過β-消去機制將透明質酸酶解為4,5-不飽和雙糖的酶。4,5-不飽和雙糖的雙鍵在紫外區205～235?nm（優選232nm）有特異性吸收峰。因此，可以利用酶解前后在205～235?nm（優選232nm）處的紫外吸收峰差值來確定透明質酸的含量。

但是，如果透明質酸發酵培養基中的營養物質成分復雜，發酵得到的發酵液自身的紫外吸收峰會有很高的吸收值，影響檢測準確性，無法進行檢測。此外，在發酵罐發酵前期或者搖瓶培養時，發酵液中透明質酸產率較低，酶解液稀釋后在232nm處的吸收值與培養基稀釋液自身在232nm的吸收值沒有明顯差異。在這種情況下，采用此方法會具有很高的實驗誤差，干擾實驗的準確性。基于這些技術難點，發明人進行了大量的研究，先對發酵液進行吸附純化，吸附純化發酵液中的雜質，降低發酵液自身在232?nm處的吸收值，然后對發酵液進行稀釋，使232nm處的紫外吸收值在可檢測的范圍，從而能使酶解前后232nm的吸收值有較大的差異，保證了檢測結果的準確性。

本發明具體技術方案如下：