[發明專利]一種快速測定發酵液中透明質酸含量的方法

有效

• 申請號: 202010547909.4
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111551513B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;石艷麗;陳玉娟;穆淑娥;郭學平;欒貽宏;周寧;魏玉潔;孫元軍
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 賈波

1.一種快速測定發酵液中透明質酸含量的方法，其特征是：將發酵液用活性炭或吸附樹脂進行吸附純化，將吸附純化后的上清液稀釋后進行酶解，使發酵液中的透明質酸徹底酶解為4,5-不飽和雙糖，然后檢測酶解前后發酵液的紫外吸收值，將酶解前后發酵液紫外吸收值的差值帶入4,5-不飽和雙糖濃度與紫外吸收值的標準曲線中，獲得該差值對應的4,5-不飽和雙糖的濃度，乘以稀釋倍數，計算得到發酵液中透明質酸的含量；所述吸附樹脂為能夠吸收蛋白、核酸、色素的樹脂。

2.?根據權利要求1?所述的方法，其特征是：用透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶進行酶解。

3.?根據權利要求1?所述的方法，其特征是包括以下步驟：

（1）向透明質酸發酵液中加入活性炭或者吸附樹脂，吸附純化后離心，取上清液；

（2）將上述上清液稀釋，然后加入透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶，使發酵稀釋液中的透明質酸徹底酶解為4,5-不飽和雙糖，酶解后滅酶、過濾，得酶解后待測液；

（3）將步驟（2）中的透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶替換為等體積的水，然后按照步驟（2）的步驟進行同樣的處理，得酶解前待測液；

（4）檢測酶解前和酶解后待測液的紫外吸收值；

（5）將酶解前后待測液的紫外吸收值的差值帶入4,5-不飽和雙糖濃度與紫外吸收值的標準曲線中，計算得到發酵液中透明質酸的含量。

4.?根據權利要求2-3?任一項所述的方法，其特征是：所述透明質酸裂解酶為細菌產透明質酸酶，所述硫酸軟骨素酶為細菌產硫酸軟骨素酶。

5.?根據權利要求4?所述的方法，其特征是：所述細菌產透明質酸酶為芽孢桿菌產透明質酸酶。

6.?根據權利要求?5?所述的方法，其特征是：所述芽孢桿菌產透明質酸酶為芽孢桿菌（Bacillus?sp.）A50?CGMCC?NO.5744?發酵生產得到的透明質酸酶。

7.?根據權利要求1-3?任一項所述的方法，其特征是：所述透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶的用量為：每1?mg?透明質酸加入500?IU~5000?IU?透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶。

8.?根據權利要求7?所述的方法，其特征是：每1?mg?透明質酸加入1000?IU~2000?IU透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶。

9.?根據權利要求3?所述的方法，其特征是：步驟（1）中，每100ml?發酵液中加入1~30g的活性炭或吸附樹脂。

10.?根據權利要求9?所述的方法，其特征是：步驟（1）中，每100ml?發酵液中加入5~10g的活性炭或吸附樹脂。

11.?根據權利要求3?所述的方法，其特征是：步驟（1）中，加入活性炭或吸附樹脂后，攪拌或振蕩0.5~1?h。

12.?根據權利要求3?所述的方法，其特征是：步驟（2）中，上清液的稀釋倍數為10~100倍。

13.?根據權利要求1?所述的方法，其特征是：用透明質酸裂解酶或硫酸軟骨素酶的酶解緩沖液對上清液進行稀釋，所述酶解緩沖液的pH?為5.0~7.0。

14.?根據權利要求13?所述的方法，其特征是：所述酶解緩沖液為pH?為5.5~6.5、濃度為50~200?mmol/L?的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。

15.?根據權利要求14?所述的方法，其特征是：所述酶解緩沖液為pH?為6.0、濃度為50~100?mmol/L?的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液。