[發明專利]應用于骨肉瘤細胞成像或治療的Au DENPs-巨噬細胞復合物

有效

• 申請號: 202010547721.X
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111840324B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 王悍;尹芳芳;史向陽;范鈺
• 申請（專利權）人: 上海市第一人民醫院
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;A61K35/15;A61K31/704;A61K9/51;A61K47/34;A61K47/10;A61P35/00;G01N24/08;G01N23/046;G01N23/04;G01T1/161;G01N15/02;G01N15/14;G01N21
• 代理公司: 上海宛林專利代理事務所(普通合伙) 31361
• 代理人: 張明

1.一種應用于骨肉瘤的細胞成像以及細胞治療的Au?DENPs-巨噬細胞復合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)取G5聚酰胺-胺樹狀大分子加入溶劑中，得到含有G5聚酰胺-胺樹狀大分子溶液的濃度為3～4mmol/L，然后加入11.8～12.5mg/mL的mPEG-MAL，攪拌反應3d，得到G5.NH₂-mPEG溶液；

(2)用水稀釋G5.NH₂-mPEG溶液，并加入HAuCl₄溶液，劇烈攪拌，獲得金/樹狀大分子混合物，所述HAuCl₄溶液與G5.NH₂-mPEG的摩爾比為100；

(3)將上述溶液劇烈攪拌30min后，加入24～30mg/mLNaBH₄溶液，繼續攪拌2h得到[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENP；

(4)在磁力攪拌下，將三乙胺加入[(Au⁰)₁₀₀-G5.NH₂-mPEG]DENP中，繼續攪拌30min后，加入乙酸酐，反應24h，其中，三乙胺濃度為730.38μg/μL，乙酰酐的濃度為1078.125μg/μL；

(5)將上述混合溶液透析3d以除去過量的反應物，凍干，獲得最終產物——Au?DENPs；

(6)使用含有10％胎牛血清的DMEM細胞培養基培養小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞，將Au?DENPs加入培養基中，培養12-48h，得到Au?DENPs-巨噬細胞復合物，其中，Au?DENPs的定量標準為[Au]為200μM；

(7)利用LPS作為陽性對照，進一步使用包括流式、PCR、免疫熒光、ELISA的技術檢測AuDENPs-巨噬細胞復合物中M1型巨噬細胞的標志物，判斷其極化狀態，其中，LPS的濃度為10ng/mL，被檢測的M1型巨噬細胞的標志物包括CD86、TNF-α、iNOS；

(8)將Au?DENPs-巨噬細胞復合物與小鼠骨肉瘤K7細胞共同孵育，使用包括流式、免疫熒光、WesternBlot的技術檢測小鼠骨肉瘤K7細胞的凋亡情況，其中，用于判斷K7細胞凋亡的指標為Annexin?V-FITC/PI或Caspase?3蛋白。

2.一種由權利要求1所述的制備方法制備得到的應用于骨肉瘤成像或治療的AuDENPs-巨噬細胞復合物，其特征在于，所述Au?DENPs-巨噬細胞復合物中的Au?DENPs內化在巨噬細胞內而非粘附于巨噬細胞表面，所述Au?DENPs-巨噬細胞復合物表達M1型巨噬細胞標志物，所述M1型巨噬細胞標志物為CD86、TNF-α和iNOS。

3.由權利要求1所述的制備方法制備得到的Au?DENPs-巨噬細胞復合物在制備用于靶向骨肉瘤CT造影劑中的應用。

4.由權利要求1所述的制備方法制備得到的Au?DENPs-巨噬細胞復合物聯合抗腫瘤藥物在制備用于治療骨肉瘤藥物中的應用。