[發明專利]一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法

有效

• 申請號: 202010546164.X
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111562210B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 李爽;劉瓊;李陽;汪瑋;王海燕;張廣民;蔡輝益
• 申請（專利權）人: 北京挑戰農業科技有限公司
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/31;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 北京知匯林知識產權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 楊華

一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法，包括以下步驟：(1)培養游離菌，梯度稀釋計活菌數，并取適量菌液離心，用無菌水重懸獲得菌懸液，備用；(2)取步驟(1)菌液，梯度稀釋，與MTT溶液反應，得到沉淀，用DMSO溶解，利用酶標儀比色，測得吸光值；(3)用步驟(1)中得到的游離菌活菌數與步驟(2)中測得的吸光值制得標準曲線；(4)取前包被樣品粉碎過篩，加入加有玻璃珠的錐形瓶中，加入破囊液，破囊，得菌懸液；(5)將菌懸液超聲，得離散菌懸液(6)將離散后的菌懸液離心，加入DMSO重懸，稀釋至不同梯度，同步驟(2)，測得吸光值；(6)根據步驟(3)中得到的標準曲線計算前包被微生態制劑中活菌數。

技術領域

本發明屬于微生物活菌數檢測技術領域，涉及一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法。

背景技術

發酵前包被微囊化培養益生菌，即在發酵前將游離菌體利用微囊化技術包裹在囊中，之后進行發酵培養，其與游離培養的益生菌相比，菌株具有更快的生長優勢，有效提高了菌株對高銅及胃腸液的耐受性，對微生物菌株起到了很好的保護作用，保證了其生理功能的發揮，解決了益生菌作為飼料添加劑所存在的效價不穩定的問題。

一種成熟的益生菌活菌計數方法應具備計數結果平行性好、重現性好等特點，但是，由于發酵前包被微囊化益生菌菌體是包被到囊中以后發酵的，這就造成了囊中菌體密度過高，菌體之間緊密結合在一起，形成生物膜而不易分離，導致現有益生菌活菌計數方法，即平板計數法不適用于此類產品的活菌數檢測。

活細胞中存在與NADP相關的脫氫酶，可將黃色的MTT還原為不溶性的藍紫色甲臢，而死細胞NADP相關的脫氫酶酶消失，MTT不會被還原，用DMSO溶解甲臢后可用酶標儀在490nm處測得溶解液的吸光值來確定活菌數。然而，傳統的MTT法不能將微囊中緊密結合的菌體在不破壞其活性的條件下均勻分散，無法準確檢測微囊中包裹的活菌數量，CN101620188A公開了一種利用四唑藍法快速測定發光細菌活細菌總數的方法，其使用MTT法檢測不同濃度活菌數制作標準曲線，再使用MTT法檢測發酵液中活菌數，但是該方法適用于菌液，測定參數不完善，不適用于微囊中緊密結合的菌體活性；CN102053123A公開了一種微囊化細胞活性的檢測方法，該方法雖然運用MTT法檢測微囊化細胞，但是其對微囊進行破囊處理的方法未考慮到對菌體細胞的損傷，且沒有表明腺苷酸能荷和活細胞數量有對應關系，因此，常規的MTT法不適用于前包被飼用微生態制劑產品的活菌數檢測。

綜上，目前在前包被微生態制劑活菌數檢測領域沒有一套適用的、成熟的檢測方法。本發明結合特有的前處理技術，融合改進后的MTT法，針對前包被微生態制劑產品樣品前處理條件、破囊液選擇以及對標菌液培養階段進行優化，開發了一種特有的適用于前包被微生態制劑產品中活菌數檢測的方法，該方法具備計數結果平行性好、重現性好且受人為因素影響小等特點。適用于其他前包被微生態產品活菌數的檢測，微生物產品包括前包被枯草芽孢桿菌，前包被地衣芽孢桿菌，前包被釀酒酵母，前包被布拉迪酵母，前包被前屎腸球菌、前包被糞腸球菌、前包被嗜酸乳桿菌、前包被植物乳酸桿菌、前包被乳酸片球菌、前包被丁酸梭菌和前包被布氏乳桿菌。

發明內容

為了解決當前前包被微生態制劑產品活菌計數問題，本發明的目的在于提供一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法，它極其顯著的改善了目前計數方法存在的缺陷，極其顯著的提高了前包被微生態制劑產品活菌檢測合格率，不僅極大的降低了人為因素的影響，且計數結果穩定，重復性高。

為了實現上述技術目的，本發明采取了如下方案：

一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法，包括以下步驟：

(1)培養游離菌，梯度稀釋計活菌數，并取適量菌液離心，用無菌水重懸獲得菌懸液，備用；

(2)取步驟(1)菌懸液，梯度稀釋，與MTT溶液反應，得到沉淀，用DMSO溶解，利用酶標儀比色，測得吸光值；