[發明專利]一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法

有效

• 申請號: 202010546164.X
• 申請日: 2020-06-16
• 公開（公告）號: CN111562210B
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發明（設計）人: 李爽;劉瓊;李陽;汪瑋;王海燕;張廣民;蔡輝益
• 申請（專利權）人: 北京挑戰農業科技有限公司
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N21/31;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 北京知匯林知識產權代理事務所(普通合伙) 11794
• 代理人: 楊華

1.一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）培養游離菌至對數生長末期，梯度稀釋計活菌數，

（2）取適量菌液離心去除上清液，用無菌水重懸獲得菌懸液，將菌懸液梯度稀釋，與MTT溶液反應，在37℃下避光處理，得到沉淀，用DMSO溶解不斷吹吸使其混勻，利用酶標儀比色，測得吸光值；所述MTT溶液，其配制方法為：稱取MTT 0.5 g，溶于100 mL的磷酸緩沖液（PBS）中，用0.22 μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，于4℃避光保存，現用現配；

（3）用步驟（1）中得到的游離菌活菌數與步驟（2）中測得的吸光值制得標準曲線；

（4）取前包被樣品粉碎過篩，加入加有玻璃珠的錐形瓶中，加入破囊液，破囊，得菌懸液，取菌懸液超聲處理，備用，所述的前包被樣品過篩條件為：過篩80-100目篩處理，取樣量為10 g，加入破囊液體90 mL，在錐形瓶中搖勻條件為：溫度25-35℃，200-250 r/min，45-60min, 所述的破囊液含有海藻糖、吐溫80和檸檬酸三鈉，每90 mL水含有海藻糖0.01-0.1 g，吐溫80 0.01-0.1 g，檸檬酸三鈉2-3 g,超聲處理條件為：功率240 W-480 W，時間3-7 min；

（5）將步驟（4）中菌懸液離心，加入DMSO重懸，稀釋至不同梯度，同步驟（2），測得吸光值；

（6）根據步驟（3）中得到的標準曲線計算前包被飼用微生態產品中活菌數。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于,步驟（1）中游離菌菌液培養溫度根據不同菌種生長特性確定，即30-37℃下培養，游離菌菌液培養至對數期末期，即20-48 h，備用。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）離心去除的上清液與重懸菌液加入的無菌水的比例為1∶1。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中在酶標板中加入菌懸液的量為100μL，加入MTT溶液40～60μL，37℃反應4～5 h，反應后溶液離心分離條件為：10000～12000 r/min，離心8-10 min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中加入DMSO的量為200～220μL，靜置時間為10～15 min，比色波長為490 nm。

6.權利要求1所述的一種前包被飼用微生態制劑產品中活菌數的檢測方法的應用，其特征在于，該MTT法同樣適用于微生態制劑產品包括前包被枯草芽孢桿菌，前包被地衣芽孢桿菌，前包被釀酒酵母，前包被布拉迪酵母，前包被屎腸球菌、前包被糞腸球菌、前包被嗜酸乳桿菌、前包被植物乳酸桿菌、前包被乳酸片球菌、前包被丁酸梭菌和前包被布氏乳桿菌。