[發明專利]一種具有高熱穩定性的黃遞酶突變體、基因及其制備方法

有效

• 申請號: 202010544855.6
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111662888B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 岳碩豪;鄭長龍
• 申請（專利權）人: 北京達成生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/32;C12R1/19
• 代理公司: 北京力量專利代理事務所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 李婷玉

本發明提供一種具有高熱穩定性的黃遞酶突變體、基因及其制備方法，其中，黃遞酶突變體是將野生型黃遞酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突變為天冬氨酸獲得的，黃遞酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。該黃遞酶突變體的酶學性質與野生型黃遞酶相同，且其熱穩定性顯著高于野生型黃遞酶，pH的穩定范圍較廣；該黃遞酶突變體的制備方法采用基因工程手段，將黃遞酶突變體基因克隆到表達載體，轉化宿主細胞進行原核表達，可獲得大量高穩定性黃遞酶突變體，為臨床診斷試劑的開發提供大量原料，降低生產成本。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種具有高熱穩定性的黃遞酶突變體、基因及其制備方法。

背景技術

黃遞酶(Diaphorases)，簡稱DIA，又稱心肌黃酶、硫辛酰胺脫氫酶。黃遞酶在體內的電子傳遞系統中起著重要的作用，能催化二氫硫辛酰胺或二氫硫辛酸脫氫，分別成為硫辛酰胺和硫辛酸外，也可催化人工電子受體還原，如某些染料、鐵氰酸鹽、醌等。脫去的兩個氫能將FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸)還原為FADH₂，再傳遞給NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸+)而形成NADH和H⁺。此外，黃遞酶在體外的應用也得到了了大量的研究，例如在生產有用的材料、能源相關材料、環境保護、醫學等領域中的應用，并且其中一些已經得到了實際應用。例如，在臨床診斷領域，以還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸磷酸根(NADPH)為底物，利用黃遞酶的特性，用于形成各種體外診斷試劑，例如可用于β-羥丁酸測定試劑盒，用來測定血清中β-羥丁酸含量。此外，黃遞酶還可用作酶電池，屬于燃料電池的一種。

黃遞酶可從豬心肌中提取，也可以由嗜熱脂肪芽孢桿菌或克氏梭菌等微生物發酵產生。而從動物的心肌中提取黃遞酶不僅操作復雜，而且產量低，不便于規模化生產。而我國目前黃遞酶主要依賴于進口，價格昂貴，且目前現有的黃遞酶熱穩定性差，用于β-羥丁酸測定試劑盒不利于準確測定β-羥丁酸含量。因此，需要一種可大量生產具有高熱穩定性黃遞酶的方法。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供一種具有高熱穩定性的黃遞酶突變體、基因及其制備方法，該黃遞酶突變體的酶學性質與野生型黃遞酶相同，且其熱穩定性顯著高于野生型黃遞酶，pH的穩定范圍較廣；該黃遞酶突變體的制備方法采用基因工程手段，將黃遞酶突變體基因克隆到表達載體，轉化宿主細胞進行原核表達，可獲得大量高穩定性黃遞酶突變體，為臨床診斷試劑的開發提供大量原料，降低生產成本。

為了解決上述問題，本發明的一方面提供一種具有高熱穩定性的黃遞酶突變體，所述黃遞酶突變體是將野生型黃遞酶氨基酸序列的第122位氨基酸由甘氨酸突變為天冬氨酸獲得的，所述黃遞酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發明對氨基酸序列為SEQ ID NO：3所示的野生型黃遞酶的第122位氨基酸進行突變，將野生型黃遞酶的第122位由甘氨酸突變為天冬氨酸，獲得的黃遞酶突變體與野生型黃遞酶、現有進口的黃遞酶相比，酶學性質接近，且其熱穩定性顯著高于野生型黃遞酶，pH適用范圍廣。

所述SEQ ID NO：1的序列結構如下：

MAKVLYITAHPHDDTQSYSMAVGKAFIETYKQVHPDHEVIHLDLYKEYIPEIDVDVFSGWGKLRSGQSFEQLSAEEKTKVGRMNELCDQFISADKYVFVTPMWNFSFPPVLKAYIDAVAVADKTFKYTAQGPIGLLTDKKALHIQARGGFYSEGPAAQMEMGHRYLEIIMQFFGVPSFEGLFVEGHAAVPEKAEEIKANAIARAKELAHTF。

所述SEQ ID NO：3的序列結構如下：