[發明專利]一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法

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• 申請號: 202010544388.7
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111830148A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 馮鄒路;李玨燕;賴春玲
• 申請（專利權）人: 南寧牟合蛋白科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 上海思牛達專利代理事務所(特殊普通合伙) 31355
• 代理人: 丁劍

本發明公開了一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，屬于宏蛋白質組學技術領域，具體包括如下步驟：(1)總蛋白提取、(2)蛋白酶解處理、(3)脫鹽處理、(4)肽段同位素標記處理、(5)肽段餾分分離處理、(6)肽段質譜鑒定、(7)質譜數據搜庫。本發明分析方法整體工藝搭配合理，步驟相對簡單，能夠高效穩定的提取宏蛋白，并能準確快速的進行搜庫分析，獲得高通量宏蛋白質組數據信息，增進了人們對微生物招募，營養資源競爭，代謝活性和防御系統在整個群落中分布的了解。

技術領域

本發明屬于宏蛋白質組學技術領域，具體涉及一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法。

背景技術

現代分子生物學揭示，自然界中微生物群落遠比人們預期的復雜和多樣，大量的不可培養微生物是潛在的資源寶庫，如何認識這些不可培養微生物以及如何對其利用是值得研究者深入思考的問題。

早期環境微生物研究主要依賴于純培養技術，依靠純培養技術所進行的研究揭示了一些有關環境微生物的組成及其多樣性的信息。但是，環境微生物僅有一小部分可培養，其余大多數為未培養微生物，宏基因組學的出現彌補了部分傳統的研究方法所存在的局限性。

宏組學(Meta-Omics)是涵蓋宏基因組學、宏轉錄組學和宏蛋白質組學的一門學科。其中宏基因組研究可以獲知環境中微生物的物種組成，目前已經開展的如火如荼；宏蛋白組描述環境中微生物的蛋白表達，由于其研究的復雜性，目前還處于起步階段，但蛋白水平的研究可以進行微生物群落的一致性、活性和功能分析，能夠提供宏基因組無法獲取的信息。

宏蛋白組學(Metaproteomics)是由Paul和Philip二人在2004年首先提出，是應用蛋白質組學技術對微生物群落進行研究的一項新技術，其定義為在特定的時間對微生物群落的所有蛋白質組成進行大規模鑒定。

宏蛋白質組學是近年來新出現的一種概念和研究技術，雖然現在已經開展的宏蛋白質組學的研究很少，但是在特殊極端環境中功能基因表達、特殊功能蛋白質的開發、生態元素循環等研究領域，宏蛋白質組學已經初步展示了其強大的功能。

2005年，美國一項針對切薩皮克海灣(Chesapeake)的蛋白質組學研究，被認為是第一個研究純天然環境的宏蛋白質組學工作，研究者利用濾膜收集了海灣不同水域的微生物群落，利用2D電泳展示了其蛋白質組，并通過質譜方法鑒定了部分蛋白。

在過去的十年中，通過將宏蛋白質組學應用于各種微生物群落，研究人員已經洞悉了不同環境微生物的關鍵功能特性。對宏蛋白質組數據集的分析提供了有關微生物群落的結構，功能和動態的信息，這對于增進對微生物招募，營養資源競爭，代謝活性和防御系統在整個群落中分布的了解至關重要。

宏蛋白質組研究存在的難點主要包括三個方面：樣品制備、質譜檢測、數據搜索。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法；先進行總蛋白的提取，然后酶解蛋白獲得肽段，iTRAQ標記肽段，高效液相色譜分餾及利用數據依賴性采集(DDA)掃描模式獲取液相串聯質譜下機數據，進行數據庫檢索。

本發明的上述技術目的是通過以下技術方案實現的：

一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，具體包括如下步驟：

(1)總蛋白提取：

1)取菌體混合物至1.5mL EP管中，加入400uL裂解液；

2)使用細胞破碎儀超聲處理，整個超聲過程將樣本置于冰水混合物中，以防超聲過程產熱使樣本溫度增高；

3)進行離心處理，控制離心轉速為12000r/min，離心20min，取上清，即獲得總蛋白液；

(2)蛋白酶解處理：