[發明專利]一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法

在審

• 申請號: 202010544388.7
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN111830148A
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 馮鄒路;李玨燕;賴春玲
• 申請（專利權）人: 南寧牟合蛋白科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 上海思牛達專利代理事務所(特殊普通合伙) 31355
• 代理人: 丁劍

1.一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)總蛋白提取：

1)取菌體混合物至1.5mL EP管中，加入400uL裂解液；

2)使用細胞破碎儀超聲處理，整個超聲過程將樣本置于冰水混合物中，以防超聲過程產熱使樣本溫度增高；

3)進行離心處理，控制離心轉速為12000r/min，離心20min，取上清，即獲得總蛋白液；

(2)蛋白酶解處理：

1)使用改良型Bradford蛋白質檢測試劑盒檢測總蛋白液中蛋白濃度，每份樣本各取100μg蛋白，使用裂解液定容至相同體積備用；

2)蛋白樣本中加入二硫蘇糖醇使其濃度為10mM/L,然后置于37℃溫度環境下還原30-60min；

3)取出蛋白樣本加入碘乙酰胺使其濃度為25mM/L，然后置于暗處室溫反應15-30min進行烷基化處理；

4)烷基化結束后，加入100mM/L TEAB使蛋白樣本中Urea的摩爾濃度小于2M/L，再用胰蛋白酶進行二步法酶切，第一次酶切加入胰蛋白酶的量與蛋白質的質量比為1:50，37℃反應16h；第二次酶切加入胰蛋白酶的量與蛋白質的質量比為1:100，37℃反應4h；

(3)脫鹽處理：

對酶解后的蛋白樣本，使用Strata X SPE柱子脫鹽，具體操作是：

1)活化：用1ml甲醇活化柱子；

2)平衡：用1ml水平衡柱子；

3)上樣：將蛋白酶解液過柱子；

4)清洗：用1ml 10％甲醇清洗柱子；

5)洗脫：用0.5ml洗脫液洗脫肽段，重復洗脫步驟一次，收集兩次洗脫的肽段液，然后使用臺式冷凍真空濃縮儀真空干燥收集的肽段洗脫液；

(4)肽段同位素標記處理：

將步驟(3)真空干燥后的肽段溶解在20μL 500mM TEAB中，使用8-plex iTRAQ試劑進行標記，標記完成后，再使用真空濃縮儀進行真空干燥；

(5)肽段餾分分離處理：

對步驟(4)真空干燥后的標記肽段用HPLC溶液A溶解，將不同標記肽段進行混合獲得上樣液，再用Waters Bridge Peptide BEH C18高pH反相柱結合Waters HPLC e2695/2998色譜儀進行肽段分離，將收集的肽段液，使用真空濃縮儀進行真空離心干燥；最后用1.5mL EP管收集肽段組分，每管收集1mL，共收集34管，真空抽干進行后續質譜鑒定；

(6)肽段質譜鑒定：

將液相分餾得到的34管肽段組分分別溶于15μl nanoLC A液，每管樣品取5ul，合并成20管樣品，進樣2ul，通過分析柱梯度洗脫進入Q Exactive組合式質譜儀鑒定；

(7)質譜數據搜庫：

使用Proteome Discoverer 1.3軟件將Q Exactive對肽段鑒定的原始圖譜文件提交至SEQUEST軟件進行數據庫檢索，獲得高度可信的定性結果。

2.根據權利要求1所述的一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，其特征在于，步驟(1)操作1)中所述的裂解液是由8M Urea、10mM DTT、2mM EDTA和1mM PMSF組成。

3.根據權利要求1所述的一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，其特征在于，步驟(1)操作2)中所述的超聲處理的條件為：功率30％，以超聲2s后停止4s的循環方式處理，控制總工作處理時間為3min。

4.根據權利要求1所述的一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，其特征在于，步驟(2)操作2)中所述的二硫蘇糖醇的濃度為1M/L；操作3)中所述的碘乙酰胺的濃度為0.5M/L。

5.根據權利要求1所述的一種基于itraq技術獲得高通量宏蛋白質組的定量分析方法，其特征在于，步驟(3)操作5)中所述的洗脫液為含有FA質量分數為2％的乙腈溶液。