[發明專利]一種用于檢測赭曲霉毒素A的熒光探針及其制備方法

有效

• 申請號: 202010540959.X
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN113372414B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 張淑華;張馨予;孫元宏;羅杰;張婷婷;王思雅
• 申請（專利權）人: 長春理工大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/13;C40B30/04;G01N33/533;G01N33/53;G01N33/58;G01N33/68;C09K11/06
• 代理公司: 吉林新發惠利知識產權代理事務所(普通合伙) 22216
• 代理人: 紀尚

一種用于檢測赭曲霉毒素A的熒光探針及其制備方法，屬于生化技術領域，其特征是：以OTA為靶標，采用噬菌體表面隨機展示十二肽庫篩選出與OTA特異性結合的重組噬菌體，通過提取重組噬菌體的單鏈DNA進行測序及序列比對，獲得了一條OTA特異性親和配體序列，Met?Pro?Met?Phe?Lys?His?Arg?Met?Phe?His?Thr?His；后通過固相多肽合成與熒光標記獲得與OTA特異性結合的熒光探針，FITC?Acp?Met?Pro?Met?Phe?Lys?His?Arg?Met?Phe?His?Thr?His。構建方法：1、特異性親和配體的篩選；2、重組噬菌體DNA的提取及目標序列確定；3、熒光探針制備；4、建立標準檢測曲線。有益效果是：1、替代OTA單克隆抗體。2、既可以定性地鑒別OTA，也檢測樣本中OTA的含量。

技術領域

本發明屬于生化技術領域。

背景技術

赭曲霉毒素是由青霉屬和曲霉屬的部分菌屬所產生的一類有毒次級代謝產物。其中赭曲霉毒素A(Ochratoxin?A,OTA)毒性最強，廣泛分布于包括啤酒、葡萄酒、咖啡豆、香料、蔬菜、茶葉、果汁、面包、大麥、小麥、玉米等各種食品和農作物中，在飼料中也普遍存在。OTA是僅次于黃曲霉毒素的真菌毒素，對人類及動物的健康造成極大的影響。主要表現為致癌、致畸、致突變、腎毒性、肝毒性、免疫毒性等，被國際癌癥研究機構列為2B類致癌物，嚴重威脅人體健康。目前檢測OTA的方法各存在一定缺陷，亟待研制新型檢測試劑，建立快速靈敏特異檢測新方法，為食品安全、人體健康提供有效保障，為經濟建設與社會發展服務。

目前，OTA檢測的常用方法有高效液相色譜法、酶聯免疫法、膠體金免疫層析法、以及時間分辨熒光免疫分析技術等。上述方法或由于成本高、周期長、對技術要求高；或由于實驗步驟復雜，儀器昂貴、前處理費時、不能現場檢測等均受到一定限制。值得注意的是，免疫測定OTA的核心技術是OTA抗體的制備，但OTA單克隆抗體的制備比較繁瑣，且費用昂貴。若通過某種較為簡便的方法獲得OTA的特異性親和配體，用以替代其單克隆抗體，則更具有實際應用價值。

噬菌體展示技術是一種將外源肽或蛋白基因與噬菌體特定蛋白基因在其表面進行融合表達的新技術，可用于對某一目標蛋白質進行篩選，從而獲得與目標蛋白質特異結合的親和配體。

發明內容

本發明的目的是：提供一種用于檢測赭曲霉毒素A的熒光探針及其制備方法，它是利用噬菌體展示技術篩選OTA特異性親和配體并獲得配體序列，該序列經過人工合成和熒光素標記獲得的多肽熒光探針可與OTA特異性結合，替代OTA單克隆抗體用于免疫檢測中。

本發明的技術方案是：

本發明的熒光探針是：以OTA為靶標，采用噬菌體表面隨機展示十二肽庫篩選出與OTA特異性結合的重組噬菌體，通過提取重組噬菌體的單鏈DNA(ssDNA)進行測序及序列比對，獲得了一條OTA特異性親和配體序列：Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His。后通過固相多肽合成與熒光標記獲得與OTA特異性結合的熒光探針：FITC-Acp-Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His。

本發明在制備配體肽熒光探針的基礎上，建立一種檢測OTA的新方法。用標準樣品包被熒光酶標板，加入一定濃度的目標熒光探針，該探針可與OTA特異性結合，隨后用適宜的緩沖液洗去未結合的熒光探針，用熒光酶標儀檢測其熒光強度，此時的熒光強度嚴格受到待測樣品的OTA含量的控制。

本發明的構建方法：

1、特異性親和配體的篩選(篩選包括非特異性洗脫和特異性洗脫)

(1)第一輪非特異性洗脫