[發(fā)明專利]一種用于檢測赭曲霉毒素A的熒光探針及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010540959.X
• 申請日: 2020-06-15
• 公開（公告）號: CN113372414B
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張淑華;張馨予;孫元宏;羅杰;張婷婷;王思雅
• 申請（專利權(quán)）人: 長春理工大學(xué)
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K1/13;C40B30/04;G01N33/533;G01N33/53;G01N33/58;G01N33/68;C09K11/06
• 代理公司: 吉林新發(fā)惠利知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 22216
• 代理人: 紀(jì)尚

1.一種用于檢測赭曲霉毒素A的熒光探針，其特征是：以O(shè)TA為靶標(biāo)，采用噬菌體表面隨機(jī)展示十二肽庫篩選出與OTA特異性結(jié)合的重組噬菌體，通過提取重組噬菌體的單鏈DNA進(jìn)行測序及序列比對，獲得了一條OTA特異性親和配體序列，Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；后通過固相多肽合成與熒光標(biāo)記獲得與OTA特異性結(jié)合的熒光探針，F(xiàn)ITC-Acp-Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；

所述熒光探針的制備方法是：

A、特異性親和配體的篩選

(1)第一輪非特異性洗脫

a、將OTA用0.1mol/L、pH8.6的NaHCO₃溶液配制成80-100μg/mL的溶液,取1mL的該溶液于無菌的聚苯乙烯培養(yǎng)皿中進(jìn)行包被，反復(fù)小心旋轉(zhuǎn)直至培養(yǎng)皿表面完全濕潤,完成后將培養(yǎng)皿放入鋪有濕紗布的塑料盒中4℃孵育12小時以上；

b、孵育12小時以上倒掉培養(yǎng)皿中的包被液，并在經(jīng)紫外照射過的濾紙上用力拍甩除去殘留的包被液，除去殘液后，向培養(yǎng)皿中加入2mL的封阻液，于3-5℃條件下封閉作用1hr以上；

c、封閉過后，按照b中所述的方法除去封阻液；然后用TBST緩沖液快速沖洗培養(yǎng)皿6次，每次都要小心旋轉(zhuǎn)以使培養(yǎng)皿的底部及邊緣均有被洗到，隨后倒掉緩沖液，并在經(jīng)紫外照射過的濾紙上拍干凈殘留在培養(yǎng)皿內(nèi)的緩沖液，進(jìn)行該操作時動作要快，以避免培養(yǎng)皿表面干燥；

d、用TBST緩沖液沖洗過后，往培養(yǎng)皿中加入1mL的TBST溶液，再加入2×10¹¹的噬菌體，于室溫條件下溫和搖動1hr；

e、充分反應(yīng)后，倒出未結(jié)合的噬菌體，并在經(jīng)紫外照射過的濾紙上拍干凈殘留在培養(yǎng)皿內(nèi)的液體；

f、按照c中所述的方法用TBST緩沖液沖洗培養(yǎng)皿10次，每次沖洗后拍甩殘留的TBST緩沖液時都要換濾紙，以防止交叉污染；

g、沖洗完后向培養(yǎng)皿中加入1mL的非特異性緩沖液，即0.2mol/L的Glycine-HCl酸堿度為pH?2.2、并含有1mg/mL?BSA，用來洗脫可與OTA特異性結(jié)合的噬菌體，于室溫條件下溫和搖動1hr，反應(yīng)過后將培養(yǎng)皿中的洗脫液吸出，放入已滅菌的微量離心管中，然后向其中加入150μL的1mol/L的Tris-HCl酸堿度為pH?9.1溶液中和上述洗脫液，中和后的溶液即為第一輪非特異性洗脫物；

(2)第一輪洗脫物滴度測定

a、接大腸桿菌ER2738單菌落于10mL已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃、175rpm的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期為OD₆₀₀＝0.5；

b、將第一輪洗脫物用已滅菌LB液體培養(yǎng)基在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，同時在37℃生化培養(yǎng)箱中溫育LB/IPTG/X-gal平板，每個噬菌體稀釋度要準(zhǔn)備一個平板備用；

c、將頂層瓊脂放置于微波爐中融化，然后在超凈工作臺內(nèi)分成3mL等份置于滅菌試管中，每個噬菌體稀釋度需要一份，分裝完后放置在45℃干燥箱中保溫備用；

d、當(dāng)ER2738菌液培養(yǎng)到對數(shù)生長期時取出，分成200μL等份存于已滅菌的微量離心管中，每個噬菌體稀釋度準(zhǔn)備一管ER2738培養(yǎng)物；然后分別向每管ER2738培養(yǎng)物中加入10μL不同稀釋度的噬菌體，快速顛倒混勻，于室溫條件下溫育3-5min；

e、將感染噬菌體的ER2738培養(yǎng)物分別加入到43-45℃條件下保溫的頂層瓊脂中，一次添加一管，快速顛倒混勻，注意不要搖出氣泡，然后立即傾注于已在37℃生化培養(yǎng)箱中預(yù)溫過的LB/IPTG/X-gal平板上，在瓊脂凝固前適當(dāng)傾斜或輕輕搖晃平板使頂層瓊脂均勻鋪開，待平板冷卻5min后，倒置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時以上；

f、檢查平板，挑選有30-100個噬菌斑的平板并計算平板上的噬菌斑數(shù)；然后用此數(shù)目乘以稀釋倍數(shù)即得到每10μL噬菌體的空斑形成單位滴度；

g、確定滴度后，計算第一輪洗脫物中噬菌體的量和第一輪非特異性篩選的回收率；

(3)第一輪洗脫物擴(kuò)增

a、接ER2738單菌落于已滅菌的LB-Tet液體培養(yǎng)基中，然后放置在全溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃，175rpm條件下培養(yǎng)12小時以上；后將ER2738培養(yǎng)物以1:100的比例稀釋于20mL的LB液體培養(yǎng)基中，向錐形瓶中加入第一輪洗脫物，混勻后，于全溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃劇烈搖動培養(yǎng)4-6hr；

b、將培養(yǎng)后的ER2738培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至已滅菌的離心管中，于4℃、10000rpm的條件下離心10min，然后將上清液轉(zhuǎn)入另一已滅菌的離心管中，同樣條件重復(fù)離心一次，將上清液上部的80％溶液轉(zhuǎn)入一新的已滅菌的離心管中，后加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4℃條件下沉淀12小時以上；

c、取沉淀過夜的溶液于4℃、10000rpm的條件下離心15min，棄去上清液，再短暫離心，然后用微量移液槍吸去殘留的上清液；

d、向沉淀物中加入1mL的TBS溶液，使沉淀物重懸，然后將重懸液轉(zhuǎn)移至已滅菌的微量離心管中，4℃條件下離心5min使溶液中殘余的細(xì)胞沉淀下來，將上清液轉(zhuǎn)移至新的已滅菌的微量離心管中，然后用1/6體積的PEG/NaCl溶液再沉淀，于冰上孵育1hr；

e、冰浴過后，于4℃、10000rpm的條件下離心10min，棄去上清，再短暫離心，用微量移液槍吸去殘留的上清液，后將沉淀物重懸于200μL?TBS含0.02％NaN₃溶液中，離心1min，沉淀溶液中任何殘余的不溶物，將上清轉(zhuǎn)移至新的已滅菌的微量離心管中，此即為擴(kuò)增后的洗脫物，記為一擴(kuò)洗脫物；

(4)一擴(kuò)洗脫物的滴度測定

根據(jù)(2)中所述的方法對一擴(kuò)洗脫物進(jìn)行滴度測定，然后計算一擴(kuò)洗脫物中噬菌體的量，并換算出相應(yīng)于2×10¹¹pfu的第二輪篩選中噬菌體的加入量，若滴度太低，可再進(jìn)行擴(kuò)增、滴度測定；

(5)第二輪非特異性洗脫

根據(jù)(1)中的步驟a-c包被一已滅菌的聚苯乙烯培養(yǎng)皿，用一擴(kuò)洗脫物中相當(dāng)于2×10¹¹pfu的噬菌體的量重復(fù)步驟d-g；另外，在清洗步驟中使用的TBST緩沖溶液中的Tween-20的濃度要增至0.5％，將最后得到的洗脫液記為第二輪洗脫物；

(6)第二輪洗脫物的滴度測定

根據(jù)(2)中所述方法對第二輪洗脫物進(jìn)行滴度測定，確定滴度后計算第二輪洗脫物中噬菌體的量和第二輪非特異性篩選的回收率；

(7)第二輪洗脫物的擴(kuò)增

根據(jù)(3)中所述方法對第二輪洗脫物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的洗脫物記為二擴(kuò)洗脫物；

(8)二擴(kuò)洗脫物滴度測定

根據(jù)(2)中所述方法對二擴(kuò)洗脫物進(jìn)行滴度測定，然后計算二擴(kuò)洗脫物中噬菌體的量并換算出相應(yīng)于2×10¹¹pfu的第三輪篩選中噬菌體的加入量，若滴度太低，可再進(jìn)行擴(kuò)增、滴度測定；

(9)第三輪特異性洗脫

根據(jù)(1)中的步驟a-c包被一已滅菌的聚苯乙烯培養(yǎng)皿，用二擴(kuò)洗脫物中相當(dāng)于2×10¹¹pfu的噬菌體的量重復(fù)步驟d-f，步驟g中的洗脫液用1mL?10μg/mL的OTA單克隆抗體配制的溶液替換，代替非特異性洗脫液進(jìn)行特異性洗脫，本次收集到的洗脫液不需要用Tris-HCl中和，即為第三輪洗脫物，清洗步驟中TBST緩沖溶液中的Tween-20的含量同樣為0.5％；

(10)第三輪洗脫物滴度測定

根據(jù)(2)中所述方法對第三輪洗脫物進(jìn)行滴度測定，確定滴度后計算第三輪洗脫物中噬菌體的量和第三輪特異性篩選的回收率，同時將有30-100個噬菌斑的滴度測定平板于4℃冰箱存放留用；B、重組噬菌體DNA的提取及目標(biāo)序列的確定

從4℃冰箱中保存的第三輪洗脫物滴度測定平板中隨機(jī)挑選40個藍(lán)斑分別進(jìn)行擴(kuò)增，然后對這些噬菌體進(jìn)行ssDNA提取，實(shí)驗(yàn)步驟如下；

(1)取擴(kuò)增后的噬菌體溶液各200μL至已滅菌的微量離心管中，分別加入等體積量的Tris飽和酚，隨后將微量離心管溫和振蕩2min，振蕩完后，于4℃、12000rpm條件下離心5min；

(2)離心后將上層水相轉(zhuǎn)移至另一已滅菌的微量離心管中，同時加入100μL的Tris飽和酚和100μL的氯仿-異戊醇溶液，它們體積比為24:1，隨后將微量離心管溫和振蕩2min，振蕩完后，于4℃、12000rpm的條件下離心5min；

(3)離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一已滅菌的微量離心管中，同時加入200μL的氯仿-異戊醇溶液，它們體積比為24:1，隨后將微量離心管溫和振蕩2min，然后，在4℃、12000rpm的條件下離心5min；

(4)離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一已滅菌的微量離心管中并記下體積，同時加入1/8體積的NaAc酸堿度為pH?4.6和500μL的-20℃冷乙醇，然后在-20℃的條件下沉淀1hr；

(5)取出微量離心管，在4℃、12000rpm的條件下離心5min，用微量移液槍吸去上清液，向沉淀中加入500μL的70％-20℃冷乙醇，在-20℃的條件下重沉淀1hr；

(6)取出微量離心管，在4℃、12000rpm的條件下離心20min，用微量移液槍迅速吸除上清液，將微量離心管放置在室溫條件下等待乙醇揮發(fā)干凈，然后往微量離心管中加入10μL的TE溶液使沉淀復(fù)溶，此即為噬菌體的ssDNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送樣測序；

(7)通過觀察比對測得的所有序列，最終獲得了一條分子量為1599.95的OTA特異性親和配體肽序列，即為，Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；

C、OTA熒光探針的制備

(1)將取代度為1.03mmoL/g的2-Chlorotrityl?Chloride?Resin樹脂用DCM溶液浸泡0.5hr使其溶脹；

(2)使用沙芯對溶劑進(jìn)行抽濾，添加3倍摩爾過量的Fmoc-His(Trt)-OH氨基酸，加入DMF溶液進(jìn)行溶解，然后添加10倍摩爾過量的DIEA，充分震蕩1hr；采用DMF和DCM交替淋洗6次，而后用甲醇進(jìn)行封閉；

(3)將DMF丟棄，添加20％哌啶DMF溶液，振蕩5min，去除DMF，再添加該溶液，充分振蕩15min；

(4)抽掉20％哌啶DFM溶液，取十幾粒樹脂，用乙醇洗三次，加入配置好的檢測試劑檢測，105℃-110℃加熱5min，變深藍(lán)色為陽性反應(yīng)；

(5)依次使用10mL/g的DMF洗兩次，10mL/g的DCM洗兩次，10mL/g的DMF洗兩次；

(6)將保護(hù)氨基酸3倍過量，HBTU?3倍過量均用盡量少的DMF溶解，加入到反應(yīng)管中，立刻加入DIEA?10倍過量.反應(yīng)30min；

(7)取十?dāng)?shù)粒樹脂，用乙醇洗三次，加入配置好的檢測試劑檢測，105℃-110℃加熱5min，無色為陰性反應(yīng)；

(8)依次使用10mL/g的DMF洗一次，10mL/g的DCM洗兩次，10mL/g的DMF洗兩次；

(9)重復(fù)(3)-(6)操作，從右到左依次連接序列中的氨基酸；連接6-Acp，最后接5-FITC，避光反應(yīng)4h，后續(xù)所有步驟全部避光處理；

標(biāo)記FITC操作方法，在避光的條件下，將合成氨基酸肽鏈的N端與6-氨基己酸的C端相連，N端連接FITC熒光素，即完成了FITC的標(biāo)記；

(10)依次使用10mL/g的DMF洗兩次，10mL/g的甲醇洗兩次，10mL/g的DMF洗兩次，10mL/g的DCM洗兩次，真空抽干10min，干燥12小時以上；

(11)從樹脂上切割多肽，將配置好的切割液加入到反應(yīng)管中，切割時間為120min；

(12)將裂解液用氮?dú)獗M量吹干，用乙醚洗六次，然后常溫?fù)]干，即可獲得FITC標(biāo)記的OTA熒光探針粗品，-20℃避光貯存；

(13)熒光探針粗品經(jīng)HPLC分離、純化，HPLC條件為，

柱溫，35℃；檢測波長，220nm；流動相A，含有0.1％TFA的水溶液；流動相B，含有0.1％的乙腈溶液；梯度洗脫，25％乙腈～45％流動相B溶液；

(14)收集目的多肽溶液放入凍干機(jī)中濃縮，凍干呈白色粉末，-20℃避光保存；

(15)熒光探針純品通過質(zhì)譜儀測定分子量為2102.53，與理論分子量相符，獲得配體肽熒光探針序列為FITC-Acp-Met-Pro-Met-Phe-Lys-His-Arg-Met-Phe-His-Thr-His；

D、建立熒光探針標(biāo)準(zhǔn)檢測曲線

(1)用前述NaHCO₃溶液將OTA標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成0.4ng/mL，0.8ng/mL，1.6ng/mL，3.2ng/mL，4ng/mL，8ng/mL，10ng/mL的溶液，然后取不同濃度的OTA溶液各200μL分別包被96孔板，同時用NaHCO₃溶液包被三個孔，每孔添加200μL作為陰性對照，包被1hr；

(2)除去包被液，向包被孔中加滿封阻液，陰性對照孔也要進(jìn)行封閉，在4℃條件下封閉1hr；

(3)除去封阻液，然后用TBST溶液洗板6次，每次倒完溶液后均要在干凈的濾紙上拍凈殘留在包被孔中的溶液，此步驟動作要快避免包被孔干燥影響結(jié)果；

(4)向包被孔中各加入200μL熒光探針溶液，陰性對照孔也不例外，于室溫條件下避光振蕩10min；

(5)后除去各孔中未結(jié)合的熒光探針溶液，用TBST溶液洗板6次，如步驟(3)中所述；

(6)向各孔中分別加入200μL的TBST溶液，然后利用多功能微孔檢測儀在528nm條件下測定熒光吸收值，建立標(biāo)準(zhǔn)檢測曲線。