[發明專利]用于檢測EVI1基因相對表達量的方法、引物和探針以及試劑盒

在審

• 申請號: 202010537585.6
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111733239A
• 公開（公告）日: 2020-10-02
• 發明（設計）人: 裘振亞;李允章;王淑一
• 申請（專利權）人: 杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關壽

本發明用于檢測AML患者外周血中EVI1基因相對表達水平，便于開展后期化療方案制定及預后預測。具體包含涉及檢測EVI1基因的上游引物EVI1?F、下游引物EVI1?R和探針EVI1?Probe，針對內參基因ABL的上游引物ABL?F、下游引物ABL?R和探針ABL?Probe等試劑。本發明經測試靈敏度高，操作簡便，可為AML患者化療方案的制定提供參考和依據，有助于患者的個體化治療。

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種用于檢測EVI1基因相對表達量的引物和探針，采用探針實時熒光定量PCR技術，預測AML預后，EVI1基因表達水平檢測可以有助于探討其與AML的預后轉歸。

背景技術

急性髓系白血病(actue myeloid leukemia，AML)是一組異質性非常強的血液系統惡性腫瘤，通常以造血干細胞的惡性克隆性增殖及分化成熟受抑為特點。其臨床特征、生物學行為、療效具有非常大的差異。根據AML的診斷和預后特點，結合現代形態、細胞遺傳學和分子生物學特征，WHO2008分型將AML做了非常細致的分類。其中伴有inv(3)(q21q26.2)或t(3；3)(q21；q26.2)的這一類白血病具有自己的特點而被單獨列為一類。此類AML常過表達EVIl(Ecotropic virus integration site 1，逆轉錄病毒整合位點1)基因，形態上可有巨核系發育異常，血小板增多，治療緩解率不足50％，長期生存率低于10％。EVIl基因又稱為MECOM基因，于1988年作為鼠白血病原病毒的插入位點基因而被認識。該基因定位于人類染色體3q26，編碼一個含有2個重要鋅指結構域的具有轉錄功能的蛋白，該蛋白的N末端有7個鋅指，而C末端有4個鋅指。它能特異性地結合基因啟動子DNA序列，發揮轉錄調節作用。事實上，EVI1已經被發現可以直接和其他一些調控轉錄及表觀遺傳相關的轉錄子相互作用，如RUNX1/AML1,SUV39H1,Smad3,HDACs,CtBP,CBP,P/CAF,DNMT3和MBD3等，通過這種相互作用的方式，進而直接影響目的基因的表達以及其他信號通路。另外，還發現在髓系祖細胞中過表達EVI1能夠影響其進一步的分化，同時影響其增殖和存活，并且EVI1在調控造血干細胞自我更新，增殖等過程中起著必不可少的重要作用。EVIl基因不僅可解除TGF-β介導的抑制細胞生長的作用，而且抑制JNK信號通路被激活引發的細胞凋亡，另外，基因水平的靶向研究結果也表明EVIl對于造血干細胞池的維持及造血干細胞分化是不可或缺的。

EVI1基因編碼一個鋅指轉錄因子，其相對分子質量為14.5萬道爾頓，這個轉錄因子定位于細胞核，是位點特異性的DNA結合蛋白，在RNA的轉錄調節中發揮作用。EVIl基因主要控制胚胎的發育，對造血干細胞的增殖和存活起重要作用。國外研究發現，過表達EVll基因不僅僅見于此類白血病，在其它核型異常的AML，甚至慢性髓細胞白血病(CML)的急變期、骨髓增生異常綜合征(MDS)的患者中也常常可以見到EVIl的過表達。在髓系腫瘤之外，上皮來源的腫瘤(包括結腸癌，卵巢癌)等均可以過表達EVll基因，近來發現，急性淋巴細胞白血病(ALL)中也有部分病例可以見到EVIl過表達。不同核型的AML中EVIl的異常表達對預后都產生了不利的影響。

EVIl過表達在所有AML中比例占到8％-12％。相似的，在最新診斷的兒童AML中，過表達EVI1的病人約占10％，并且在成人和兒童AML患者中，過表達EVI1都有著較差的預后。有研究表明，部分病人表現較高的EVI1 mRNA表達水平，也有一部分病人表達較低的EVI1表達,其中，AML-M1和AML-M6顯著低表達EVI1，AML-M3和AML-M5過表達EVI1。國內有關EVIl基因表達及與臨床和細胞遺傳學關系的研究很少。深入研究EVIl高表達患者的臨床和細胞遺傳學特征，有利于提高患者的緩解率，改善預后。