[發(fā)明專利]一種Slfn4缺失的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202010537546.6
• 申請(qǐng)日: 2020-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN111778278B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭前前;梁銀明;盧燎勛;晁天柱;張黎琛;黃蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027;A61K49/00;A61K45/00;A61P9/10
• 代理公司: 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發(fā)明涉及一種Slfn4缺失的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明將Slfn4基因敲除通過CRISPR?Cas9系統(tǒng)引入ApoE基因缺失遺傳背景的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠，回交和雜交后進(jìn)行基因型篩選，獲得了雙基因缺失的純合子模型小鼠ApoE^–/–Slfn4^–/–。Slfn4缺失動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠(ApoE^–/–Slfn4^–/–)較ApoE^–/–小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯著減少，癥狀顯著減輕，表明Slfn4基因具有促進(jìn)主動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用。針對(duì)Slfn4上述功能，Slfn4可以作為藥物靶標(biāo)篩選治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物；Slfn4抑制劑能夠用于制備治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種Slfn4缺失的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于基因工程和遺傳修飾技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

動(dòng)脈粥樣硬化為血管阻塞性疾病的主要原因，由其所致腦梗死、心肌梗死等是我國首要致殘、致死性疾病。動(dòng)脈粥樣硬化的形成、發(fā)展與單核巨噬細(xì)胞密切相關(guān)，后者吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞沉積于血管壁、釋放細(xì)胞因子并招募免疫細(xì)胞形成慢性炎癥，是動(dòng)脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)。

慢性炎癥是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的核心因素。免疫細(xì)胞不斷遷移到血管壁，與脂質(zhì)等共同聚集導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。斑塊破裂后血栓形成、從而導(dǎo)致腦梗死、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等致殘、致死性后果。而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的免疫細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞，后者來源于循環(huán)血液中單核細(xì)胞，吞噬脂質(zhì)后形成泡沫細(xì)胞。單核巨噬細(xì)胞對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用體現(xiàn)在兩個(gè)方面：第一、動(dòng)脈粥樣硬化形成早期，血液中的單核細(xì)胞通過內(nèi)皮間隙，在內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞；巨噬細(xì)胞通過清道夫受體CD36結(jié)合并吞入氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)，酪氨酸激酶Lyn發(fā)生磷酸化，磷酸化的Lyn級(jí)聯(lián)激活JNK1/2或Vav等，促進(jìn)Ox-LDL攝取，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積，形成泡沫細(xì)胞。第二、進(jìn)入內(nèi)膜后，單核細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)等因子作用下分化成兩類巨噬細(xì)胞：經(jīng)典促炎型(M1)和抑炎型(M2)巨噬細(xì)胞，分別集中于不穩(wěn)定和穩(wěn)定斑塊中，并對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。二者在斑塊中呈動(dòng)態(tài)變化，巨噬細(xì)胞數(shù)量和分型影響斑塊的進(jìn)展。因此，減輕巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和炎癥反應(yīng)的調(diào)控措施對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病具有重要意義。

髓樣分化因子Slfn4特異且高豐度表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞，而單核巨噬細(xì)胞對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的有著關(guān)鍵影響，但Slfn4在高脂血癥條件下對(duì)單核巨噬細(xì)胞的分化、泡沫細(xì)胞形成的作用還缺乏研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種Slfn4缺失的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的構(gòu)建方法，并通過該模型探索Slfn4基因在動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用，提供Slfn4作為靶標(biāo)用于篩選治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病的藥物以及Slfn4抑制劑在制備治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種Slfn4缺失的動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠的構(gòu)建方法：先將ApoE^–/–小鼠的Slfn4基因敲除，獲得F0代小鼠；再對(duì)F0代小鼠進(jìn)行基因型鑒定選擇Slfn4基因敲除的F0代ApoE^–/–背景小鼠，并將其與ApoE^–/–小鼠進(jìn)行回交獲得F1代Slfn4基因雜合子小鼠；最后將F1代Slfn4基因雜合子小鼠進(jìn)行自交獲得F2代小鼠，對(duì)F2代小鼠進(jìn)行基因型鑒定篩選，獲得Slfn4雙等位基因敲除且ApoE雙等位基因敲除的純合子個(gè)體即為Slfn4基因敲除動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠。

所述F0代小鼠的獲得具體包括如下步驟：

1)靶向小鼠Slfn4基因的sgRNA的選擇：CRISPR-Cas9系統(tǒng)中sgRNA作用位點(diǎn)位于Slfn4基因的2號(hào)外顯子區(qū)，sgRNA作用位點(diǎn)DNA靶序列分別如下所示：