[發(fā)明專利]一種Slfn4缺失的動脈粥樣硬化模型小鼠的構建方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010537546.6
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111778278B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設計）人: 鄭前前;梁銀明;盧燎勛;晁天柱;張黎琛;黃蓉
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/12;A01K67/027;A61K49/00;A61K45/00;A61P9/10
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.一種Slfn4缺失的動脈粥樣硬化模型小鼠的構建方法，其特征在于，先將ApoE^–/–小鼠的Slfn4基因敲除，獲得F0代小鼠；再對F0代小鼠進行基因型鑒定選擇Slfn4基因敲除的F0代ApoE^–/–背景小鼠，并將其與ApoE^–/–小鼠進行回交獲得F1代Slfn4基因雜合子小鼠；最后將F1代Slfn4基因雜合子小鼠進行自交獲得F2代小鼠，對F2代小鼠進行基因型鑒定篩選，獲得Slfn4雙等位基因敲除且ApoE雙等位基因敲除的純合子個體即為Slfn4基因敲除動脈粥樣硬化模型小鼠；

所述F0代小鼠的獲得是采用CRISPR/Cas9技術將ApoE^–/–小鼠的Slfn4基因敲除；

所述 F0代小鼠的獲得包括以下步驟：

1)靶向小鼠Slfn4基因的sgRNA選擇：CRISPR-Cas9系統(tǒng)中sgRNA作用位點位于Slfn4基因的2號外顯子區(qū)，sgRNA作用位點DNA靶序列分別如下所示：

Slfn4-sgRNA1：5’- AGGTGCAGGATACCAGGCAA GGG-3’；

Slfn4-sgRNA2：5’- AAGCCGAATCAGAGAGGTCC GGG-3’；

Slfn4-sgRNA3：5’- CTCAGTTGAACTGAAAGCAG CGG-3’；

2)引物設計：根據(jù)步驟1）獲得的sgRNA靶序列設計4條引物，引物序列如下所示：

Slfn4-IVT-1：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGAGGTGCAGGATACCA

GGCAAGTTTTAGAGCTAGA-3’；

Slfn4-IVT-2：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGAAGCCGAATCAGAGA

GGTCCGTTTTAGAGCTAGA-3’；

Slfn4-IVT-3：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGCTCAGTTGAACTGAA

AGCAGGTTTTAGAGCTAGA-3’；

Slfn4-IVT-4：5’-AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC-3’；

3)合成雙鏈DNA片段：將步驟2）中的Slfn4-IVT-1、Slfn4-IVT-2、Slfn4-IVT-3分別與Slfn4-IVT-4配對，以pX330質(zhì)粒為模板，進行聚合酶鏈式反應并對獲得的DNA擴增產(chǎn)物進行純化；

4)獲得sgRNA和Cas9 mRNA：分別以步驟3）中雙鏈DNA片段為模版，體外轉錄并純化，獲得sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3；以AgeI單酶切線性化的pST1374-Cas9質(zhì)粒為模版，體外轉錄并純化，獲得Cas9 mRNA；

5)獲得Slfn4缺失的F0代小鼠：將步驟4）獲得的3個sgRNA和Cas9 mRNA等比例注射由ApoE^–/–小鼠精子和C57BL/6小鼠卵細胞體外受精產(chǎn)生的受精卵細胞，獲得Slfn4基因敲除的受精卵細胞并其移植至假孕雌鼠，出生的小鼠即為Slfn4基因敲除的F0代小鼠。

2.根據(jù)權利要求1所述的Slfn4缺失的動脈粥樣硬化模型小鼠的構建方法，其特征在于，Slfn4基因敲除小鼠的基因型鑒定的引物如下所示：

Slfn4-GeneTy-F：5’- TCGGAGAGAAGACTAGGGATTCA-3’；

Slfn4-GeneTy-R：5’- GCAGAAACAGTTTGAGGGAGG-3’。

3.根據(jù)權利要求2所述的Slfn4缺失的動脈粥樣硬化模型小鼠的構建方法，其特征在于，采用瓊脂糖凝膠電泳對Slfn4基因型進行分析。

4.利用如權利要求1所述的構建方法得到的Slfn4缺失的動脈粥樣硬化模型小鼠在研究動脈粥樣硬化疾病發(fā)生、發(fā)展方面的應用。

5.Slfn4作為藥物靶標在篩選治療動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用。

6.Slfn4抑制劑在制備治療動脈粥樣硬化疾病藥物中的應用。