[發明專利]一種德國鳶尾胚性愈傷組織低溫保存的方法

有效

• 申請號: 202010536083.1
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111887154B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 張永俠;原海燕;劉清泉;王銀杰;楊永恒;張婷;徐曉洋;孫玉明;黃蘇珍
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及植物愈傷組織的保存，具體涉及一種德國鳶尾胚性愈傷組織低溫保存方法。具體步驟包括：a、胚性愈傷組織的準備；b、包埋：將胚性愈傷放入添加質量濃度為2～4%海藻酸鈉的包埋劑中，混合均勻，然后用吸管每次吸取一塊胚性愈傷，滴到濃度為2～4%CaCl₂溶液中進行離子交換一段時間后，用無菌水漂洗兩次，終止反應，撈起晾干后得到包埋好的胚性愈傷小球；c、低溫保存：將包埋好的小球置于無菌三角瓶中，封口膜封口后保存于4℃的黑暗環境中；d、復蘇：根據實際需要將低溫保存的愈傷組織取出，置于胚性愈傷組織增殖培養基上，觀察復蘇效果。本發明使德國鳶尾胚性愈傷組織的繼代周期延長近8個月，且復蘇后的愈傷與正常增殖的愈傷無明顯差異。本發明初步建立了德國鳶尾胚性愈傷組織的中短期保存體系，具有愈傷保存穩定性好，操作簡單，降低成本等優點。

技術領域

本發明涉及植物愈傷組織的保存，具體涉及一種德國鳶尾胚性愈傷組織低溫保存方法。

背景技術

德國鳶尾（Iris germanica L.)為鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(Iris. L)多年生草本，是世界著名的宿根花卉之一，耐寒性強，葉叢美觀，花型奇特，花大色艷，具有較高的觀賞價值，世界各地廣為栽培，在園林綠化、盆栽及地被中有巨大的應用空間。然而目前國內應用的德國鳶尾品種均引自國外，不但品種數量少、種源有限、且價格昂貴。因此迫切希望獲得具有自主知識產權的優良德國鳶尾新品種，來滿足市場的需求。

德國鳶尾的育種因受種間雜交障礙，育種周期長，雜交后代種苗較少等的影響，嚴重阻礙了其新品種選育。而通過植物體細胞融合及遺傳轉化等方法選育新品種，具有打破有性生殖隔離，克服遠源雜交障礙等優點，是德國鳶尾獲得新品種的有效有段。但建立高效穩定的德國鳶尾再生體系是體細胞融合及遺傳轉化的基礎。目前，德國鳶尾以其莖尖和花器管為外植體誘導胚性愈傷組及再生體系已建立，但花器管的取材受季節的限制及莖尖的取材對母株的損失較大且污染嚴重，因此獲得的胚性愈傷組織顯得尤為珍貴。前期研究表明，德國鳶尾胚性愈傷組織的繼代周期為3-4周，繼代周期短，但過多的繼代次數不僅消耗大量的人力物力，增加污染幾率，還會影響胚性愈傷組織的遺傳穩定性。因此尋求胚性愈傷組織的中短期保存方法，方便根據實際研究情況，快速復蘇胚性愈傷組織，對以其為材料進行的研究具有重要意義。

超低溫保存法是長期維持植物材料遺傳資源安全穩定的常用方法。但該技術操作繁瑣，凍存和和復蘇過程都會造成細胞損傷，影響保存材料的再生能力。另外，保存過程需要程控降溫儀和超低溫保存箱等昂貴的儀器，成本較高。因此，本發明通過對德國鳶尾胚性愈傷組織的中短期低溫保存方法進行探索，以期初步建立德國鳶尾胚性愈傷組織的中短期低溫保存體系。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種德國鳶尾胚性愈傷組織低溫保存方法。

為實現本發明的目的，本發明采用的技術方案是：

提供一種德國鳶尾胚性愈傷組織的低溫保存方法，具體包括下述步驟：

（1）胚性愈傷組織的準備：

將繼代2～3次的胚性愈傷組織切成約2 mm的小塊備用；

（2）包埋

將步驟（1）中的胚性愈傷放入到包埋劑中，混合均勻；用吸管吸取胚性愈傷組織，垂直滴到CaCl₂溶液中進行離子交換反應一段時間，然后以無菌水漂洗2次，終止反應，撈起晾干得到胚性愈傷的包埋小球；

（3）保存

將步驟（2）得到的愈傷包埋小球，置于無菌三角瓶，密封后保存于4℃，黑暗條件下保存；

（4）復蘇：

取步驟（3）中低溫保存一定時間后的胚性愈傷組織小球接種到胚性愈傷組織增殖培養基上，置于培養室，25 ℃黑暗條件下過渡培養一周后，光下常規培養。