[發明專利]斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟小干擾RNA組合物、試劑盒及使用方法

有效

• 申請號: 202010535694.4
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111621501B
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 邱麗華;趙超;彭超
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院南海水產研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/713;A61K9/08;A61K47/36;A61P15/08
• 代理公司: 廣州海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 高東陽;馬赟齋

本發明公開了一種斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟小干擾RNA組合物，包含針對斑節對蝦CHH、MIH和VIH 3個抑制性腺發育的激素基因的小干擾RNA，所述三個小干擾RNA具體為CHH?siRNA、MIH?siRNA和VIH?siRNA，其中CHH?siRNA的正義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；MIH?siRNA的正義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，反義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；VIH?siRNA的正義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，反義鏈核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本發明還公開了包含上述小干擾RNA組合物的斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟試劑盒及使用方法。所述小干擾RNA組合物可顯著減少抑制雌性親蝦性腺發育成熟激素的含量，促進卵黃蛋白的生成，加速性腺發育進程。

技術領域

本發明涉及小干擾RNA組合物及其應用，具體涉及斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟小干擾RNA組合物，同時還涉及了斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟試劑盒及該試劑盒的使用方法。

背景技術

對蝦等甲殼類動物眼柄內存在諸如甲殼類高血糖激素(Crustaceanhyperglycemic hormone,CHH)、蛻皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone,MIH)、大顎器抑制激素(Mandibular organ-inhibiting hormone,MOIH)、卵黃生成抑制激素(Vitellogenesis-inhibiting hormone,VIH)等多種抑制性腺發育的激素，雌性親蝦性腺在自然條件下難以大批量集中成熟，影響蝦類苗種生產，所以商業性培育蝦類苗種時通常采用眼柄剪除技術對雌性親蝦性腺進行催熟。該技術在一定程度上可以有效的促進雌性親蝦性腺發育，但隨著產業發展，其弊端也不斷暴露：首先，剪除雌性親蝦眼柄會導致其卵巢持續發育、產卵，加速了卵巢衰竭，對親蝦具有不可逆性損傷；再者，該技術導致親蝦產卵質量逐茬降低，蝦苗品質良莠不齊，影響養殖經濟效益。因此，開發新的安全高效便利的催熟方法勢在必行。

為解決上述難題，一些試圖通過調控內分泌系統而非剪眼柄的方法被用來促熟親蝦。如通過注射五羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、甲基法尼脂(Methyl Farnesoate,MF)、多巴胺(Dopamine,DA)等神經遞質，或通過雙鏈RNA干擾技術特異性抑制VIH基因的轉錄，降低親蝦體內VIH含量，進而實現調控親蝦卵巢發育成熟的目的；通過人工調控溫度、鹽度、光周期等環境因子改變性腺發育相關激素水平，進而調控生殖細胞的形成和卵黃蛋白的合成等，促進親蝦產卵。

上述促熟親蝦的嘗試雖在實驗條件下可以加速雌性親蝦性腺發育成熟，但要在實際生產實踐中批量應用仍存在許多亟待解決的問題，比如：5-HT、MF等神經遞質價格昂貴，單只親蝦注射成本高達萬元，促熟親蝦成功率低(70％)，且蝦苗成活率低(65％)，性價比低；雙鏈RNA制劑雖然促熟成功率高(95％)，但是針對不同批次親蝦效果并不穩定，且雙鏈RNA制劑極易降解，難保存，不利于推廣示范。

殼聚糖(chitosan，CS)又稱脫乙酰甲殼素，是一種來源于海洋生物的天然的高分子材料，具備良好的安全性、生物相容性和生物可降解性等特點。殼聚糖分子在酸性條件下以帶正電荷的葡糖胺基為主，該物質可與帶負電荷的DNA、dsRNA、siRNA等大分子結合形成穩定的多聚復合物，核酸被包裹在該復合物內部不易被核酸酶降解，核酸穩定型顯著提高。鑒于此，殼聚糖在近年來常被用于藥物緩釋載體，殼聚糖-核酸多聚復合物在生產中的應用前景廣闊，但在斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟中的應用目前尚未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效的斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟小干擾RNA組合物，其可顯著減少抑制雌性親蝦性腺發育成熟激素(CHH、MIH和VIH)的含量，促進卵黃蛋白的生成，加速性腺發育進程。

本發明的第二個目的在于提供高效、易保存、低成本的斑節對蝦雌性親蝦性腺促熟試劑盒。

本發明的第三個目的在于提供上述試劑的使用方法。