[發明專利]一種編輯綿羊FGF5基因實現選擇性剪接的sgRNA、成套核酸分子和應用

有效

• 申請號: 202010533989.8
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111518812B
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 李文蓉;劉明軍;李忠慧;劉晨曦;劉金瑞;瑪依拉;陳磊;徐亞芳
• 申請（專利權）人: 新疆畜牧科學院生物技術研究所（新疆畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心）
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/867
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 李正

本發明提供了一種編輯綿羊FGF5基因實現選擇性剪接的sgRNA、成套核酸分子和應用，屬于細胞工程和基因工程技術領域，所述sgRNA由如SEQ?ID?No.1～6所示的核苷酸序列退火得到；所述SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2兩兩退火；所述SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4兩兩退火；所述SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6兩兩退火。本發明提供的sgRNA能夠實現對綿羊FGF5基因選擇性剪接的編輯。

技術領域

本發明屬于細胞工程和基因工程技術領域，尤其涉及一種編輯綿羊FGF5基因實現選擇性剪接的sgRNA、成套核酸分子和應用。

背景技術

CRISPR/Cas9系統是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御系統，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR/Cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。該基因編輯技術系統主要由Cas9核酸酶和sgRNA組成。Cas9核酸酶具有切割雙鏈DNA的活性結構域，使得雙鏈DNA斷裂；sgRNA是由起支架功能的tracrRNA與特異性的crRNA結合形成的嵌合RNA。sgRNA通過RNA-DNA堿基互補配對將Cas9/sgRNA復合物靶向募集到目的基因，Cas9再通過識別目的基因上的PAM基序(5’-NGG-3’)定點切割雙鏈DNA，進而對目的基因起到編輯作用。

CRISPR/Cas9慢病毒系統(Lentiviral?CRISPR/Cas)可以感染多種哺乳動物細胞，該系統可以共同表達一種哺乳動物編碼優化的Cas9核酸酶和sgRNA，以促進基因組編輯。慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別于一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，從而達到良好的基因治療效果。

慢病毒載體構建原理：慢病毒載體的包裝系統一般由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能夠反式提供產生病毒顆粒所必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補，即含有包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。將包裝成分與載體成分的多個質粒共轉染包裝細胞，即可在細胞上清中收獲攜帶目的基因的復制缺陷型慢病毒載體顆粒。收集到的細胞上清可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。

FGF5基因屬于成纖維細胞生長因子FGFs(一類調節細胞生長的多功能肽類生長因子)家族成員之一，其被認為在毛發生長過程中抑制了毛發的生長期，而這一功能可以被FGF5變位剪接體方式產生的截短型FGF5(FGF5s)所調控，并可解除FGF5對毛發生長的抑制作用。截短型FGF5(FGF5s)是FGF5?mRNA在成熟過程中發生選擇性剪接的產物。選擇性剪接(也叫可變剪接)是指從一個mRNA前體中通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點組合)產生不同的mRNA剪接異構體的過程，使得最終的蛋白產物會表現出不同或者是相互拮抗的功能和結構特性，或者在相同的細胞中由于表達水平的不同而導致不同的表型。已有研究發現，從大鼠、小鼠和人腦組織中可分離出兩種FGF5亞型。其中一種亞型為FGF5全長mRNA，包含3個外顯子；另一亞型為截短型FGF5(FGF5s)，即FGF5全長mRNA序列中的外顯子2通過變位剪接體方式被切除。但是現有技術還未有關于利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術對綿羊FGF5基因進行選擇性剪接的相關報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種編輯綿羊FGF5基因實現選擇性剪接的sgRNA、成套核酸分子和應用，本發明提供的sgRNA能夠實現對綿羊FGF5基因進行選擇性剪接的編輯。

為了實現上述發明目的，本發明提供了以下技術方案：