[發明專利]一種鑒定藥物靶蛋白的方法

在審

• 申請號: 202010533388.7
• 申請日: 2020-06-12
• 公開（公告）號: CN111551749A
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發明（設計）人: 姚亞婷;邱建閣;劉兵潔;張瀟;周風梅;江秉華
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供一種鑒定藥物靶蛋白的方法，其具體步驟包括：以細胞為樣品，加入細胞裂解液，采用液氮反復凍融法獲得細胞中的蛋白質組樣品；將上述所得蛋白質組樣品平均分為兩份，其中一份加入一定體積一定濃度的藥物母液而得到實驗組樣品，另一份加入等量的DMSO而得到對照組樣品；使用含金屬離子(Mⁿ⁺)的鹽溶液分別對實驗組和對照組樣品進行處理，獲得一系列具有Mⁿ⁺終濃度梯度的實驗組和對照組樣品，離心分離得到上清液和沉淀部分；對上述步驟中得到的上清液樣品或沉淀部分樣品進行蛋白質定量檢測分析；和，對上述步驟中的測定數據進行分析評價，繪制各個蛋白質的溶解度曲線，實驗組和對照組的溶解度曲線有顯著性差異的蛋白質即為鑒定到的藥物靶蛋白。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種鑒定藥物靶蛋白的方法。

背景技術

準確識別藥物的靶蛋白、揭示藥物的作用和脫靶機制可以為新型藥物的研發提供關鍵信息，為藥物在臨床應用中可以更好地發揮療效提供理論支持。

經典的藥物靶蛋白鑒定方法主要包括親和色譜法(Affinity chromatography)和基于活性的探針分析法(Activity-based probe profiling,ABPP)。親和色譜法是將藥物或者具有活性的小分子固載到固體基質上，然后與細胞裂解液進行孵育來捕獲與藥物或小分子有相互作用的蛋白質。這種方法比較典型的應用是通過固定非選擇性激酶抑制劑(kinobeads)進行激酶篩選來構建蛋白質激酶與抑制劑的相互作用網絡。基于活性的探針分析原理是合成同時帶有反應基團和標簽基團的小分子化學探針來對靶蛋白進行識別和鑒定。由于探針與其相互作用蛋白質之間通過共價鍵結合，因此該方法非常適合那些與藥物親和力很弱的靶蛋白的鑒定。但是這兩種方法通常都需要對小分子藥物進行化學修飾或者衍生，這可能會導致小分子藥物的結構、活性以及其與靶蛋白之間的親和力發生改變。另外，由于小分子藥物的非特異性結合還會造成一些假陽性的鑒定結果。因此，為了減少實驗過程中由于藥物修飾環節所帶來的不良影響，亟需要發展無化學修飾的方法用于藥物靶蛋白的鑒定。

近年來，隨著生物質譜儀和蛋白質組學技術的快速發展，一些基于蛋白質結構和穩定性變化分析的蛋白質-藥物檢測策略得到了發展。如Martinez等人在2013年報道的CETSA(Cellular thermal shift assay,CETSA)是一種的體外藥物靶蛋白篩選技術，依賴于配體可以穩定蛋白質的原理，通過監測藥物結合引起的蛋白質熱穩定性變化來確定藥物靶蛋白。最近Zhang等人開發了一種溶劑誘導的蛋白沉淀(Solvent-induced proteinprecipitation,SIP)方法在蛋白質組學層面上鑒定藥物靶蛋白。該方法基于的概念是與藥物結合的蛋白質更不容易被有機溶劑變性沉淀，有助于熱穩定性變化不顯著的靶蛋白的發現及鑒定。這兩種技術的關鍵都是利用蛋白質變性沉淀的過程，通過對比藥物結合前后蛋白質分別在熱穩定性和有機溶劑耐受性方面的差異來識別靶蛋白。眾所周知，除了加熱、有機溶劑可以使蛋白質變性沉淀之外，金屬鹽也是一類非常有效的蛋白質沉淀劑，因此本發明采用金屬離子誘導蛋白質沉淀技術結合蛋白質定量分析策略，發展一種藥物靶蛋白鑒定新方法。該方法可在不對藥物分子進行任何化學修飾的情況下實現對藥物靶蛋白的無歧視性、高靈敏度和高通量鑒定，為藥物的作用機理和脫靶機制研究提供依據。

發明內容

本發明的目的在于提供一種鑒定藥物靶蛋白的方法，從而為藥物作用機制研究和新藥研發提供理論依據。

一種鑒定藥物靶蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)以細胞為樣品，加入細胞裂解液，采用液氮反復凍融法獲得細胞中的蛋白質組樣品；

(2)分別制備實驗組和對照組樣品，所述實驗組樣品為上述步驟獲得的蛋白質組樣品中加入一定體積一定濃度的藥物母液于室溫下旋轉孵育而獲得；所述對照組樣品為與實驗組等量的上述步驟獲得的蛋白質組樣品中加入與藥物母液等體積的DMSO于室溫下旋轉孵育而獲得；