[發明專利]一種高靈敏度和特異度的sdLDL-C比色法檢測試劑盒及其制備使用方法

有效

• 申請號: 202010532055.2
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111551512B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 芮雙印;符修樂
• 申請（專利權）人: 安徽大千生物工程有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78
• 代理公司: 合肥興東知識產權代理有限公司 34148
• 代理人: 李靜

1.一種高靈敏度和特異度的sdLDL-C比色法檢測試劑盒，其特征在于，包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分；

所述試劑R1包括的成分及相應含量為：MOPS緩沖液20~80?mM，PEG?6000?100~200?g/L，BSA?20~30?g/L，NaCl?1.8~18?g/L，NaN_3?0.2~0.8?g/L，EDTA?0.1~1?g/L，過氧化氫酶500~900?U/L，膽固醇酯酶200~800?U/L，膽固醇氧化酶100~1000?U/L，TOOS?10~15?mM，表面活性劑I?0.05~0.1%，其溶劑為純化水；

所述試劑R2包括的成分及相應含量為：MOPS緩沖液20~80?mM，PEG?6000?100~200?g/L，BSA?20~30?g/L，NaCl?1.8~18?g/L，NaN_3?0.2~0.8?g/L，EDTA?0.1~1?g/L，4-AAP?0.5~2?mM，過氧化物酶10~20?U/L，mPEG-PlD?5~15?mg/L，表面活性劑II?0.05~0.8%，其溶劑為純化水；

其中，所述試劑R1中的表面活性劑I由日光公司產品NIKKOL?BT-9和NIKKOL?BT-12中的一種或幾種構成；所述試劑R2中的表面活性劑II由西寶公司產品Brij-35和DTAC中的一種或幾種構成；

同時，所述mPEG-PlD的獲取方法如下：

①重組磷脂酶D的制備：

a.?于GENBANK獲取磷脂酶D全部CDS，于首尾分別添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位點，即得目標序列，具體如SEQ?ID?NO.1所示；

b.?得到目標序列后，送基因公司合成；

c.?雙酶切后連接至表達載體pET32a上，并導入到表達菌Ecoli；

d.?涂布于氨芐平板上，并挑取陽性菌進行發酵表達；

e.?離心取上清，過鎳柱進行親和層析，即得目的產物；

②重組磷脂酶D的mPEG化：

a.?將氰尿酰氯?5.5g、無水Na₂CO_3?10g、分子篩5A?5g及mPEG-5000?50g溶于400?mL的無水苯中，常溫下攪拌反應12?h；

b.?離心去除Na₂CO₃、分子篩5A懸浮物，用600?mL的乙醚沉淀，再用400?mL的無水苯溶解沉淀；如此沉淀、溶解反復5次，去除沒有反應的氰尿酰氯，直至在258?nm波長下檢測無光吸收；最后，進行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；

c.?取上述CC-mPEG與步驟①制備的重組磷脂酶D，將二者溶解于10?mL硼酸鹽緩沖液，于搖床室溫反應3~6?h后，15?kD透析過夜，即得修飾酶液，記為mPEG-PlD。

2.根據權利要求1所述的高靈敏度和特異度的sdLDL-C比色法檢測試劑盒，其特征在于，還包括sdLDL校準品；所述sdLDL校準品包括的成分及相應含量為：MOPS緩沖液20~80mM，BSA?20~30?g/L，sdLDL-C?5~15?mg/L，NaN_3?0.2~0.8?g/L，其溶劑為純化水。

3.根據權利要求2所述的高靈敏度和特異度的sdLDL-C比色法檢測試劑盒，其特征在于，所述sdLDL-C的獲取方法如下：配制肝素-Mg²⁺，其中，肝素濃度150?U/mL，Mg²⁺濃度90mmol/L；按10%添加量在上述肝素-Mg²⁺中加入50?mL人血清，混勻，室溫靜置15?min，然后在1500?g條件下離心30?min；取此上清液40?mL，并再加入4?mL肝素-Mg²⁺，混勻，室溫靜置15min；最后，再于1500g條件下離心30?min，此上清即為sdLDL-C產物。