[發(fā)明專利]CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202010531552.0
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111748539B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 逄曉陽;李偉勛;楊蘭;呂加平;蘆晶;張書文;朱青;徐琛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113;C12N15/74;C12N15/85;C12N15/90
• 代理公司: 北京遠(yuǎn)大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11369
• 代理人: 卞靜靜

本發(fā)明公開了一種CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用，CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)包括：LpCas9蛋白和sgRNA復(fù)合體，能精確定位靶向DNA序列，并產(chǎn)生切割，使DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷；所述LpCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。本發(fā)明能有效解決spCas9應(yīng)用于副干酪乳桿菌上存在的異源密碼子偏好性和細(xì)胞毒性的問題；通過導(dǎo)入人為設(shè)計(jì)的CRISPR RNA和修復(fù)模板在細(xì)胞中或體外進(jìn)行基因編輯，有效解決了菌株因自身特性或攜帶代表質(zhì)粒較大等原因所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化效率過低的問題，同時(shí)其在基因編輯領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因編輯技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

CRISPR/cas9系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌中存在的一種獲得性免疫系統(tǒng)，現(xiàn)已作為一種基因編輯工具被廣泛的應(yīng)用。

在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，Cas9蛋白與crRNA及tracrRNA形成核酸蛋白復(fù)合體，通過對靶位點(diǎn)附近的PAM序列的識別決定crRNA與靶序列的結(jié)合。當(dāng)掃描到功能性的PAM位點(diǎn)時(shí)，Cas9與非PAM所在鏈結(jié)合，檢查crRNA中的間隔區(qū)與目標(biāo)DNA之間的序列匹配性。如果在種子區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)不匹配，那么Cas9將會對DNA雙鏈進(jìn)行精準(zhǔn)切割。研究人員將crRNA和tracrRNA融合為一條RNA，稱為sgRNA，并不影響其系統(tǒng)效率。

CRISPR系統(tǒng)在乳酸菌中的應(yīng)用仍然受到很大限制，目前應(yīng)用最廣泛的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，是基于釀膿鏈球菌的spCas9為核心構(gòu)建的，其在乳桿菌中的應(yīng)用因?yàn)榧?xì)胞毒性、異源蛋白密碼子偏好性等的影響受到限制。

另外，Cas9蛋白表達(dá)載體是組成型表達(dá)，構(gòu)建敲除系統(tǒng)所用質(zhì)粒較多或過大，對電轉(zhuǎn)效率有所影響，這也是限制spCas9在乳桿菌應(yīng)用的因素。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)，其來源于乳酸菌的Cas9基因編輯工具，能有效解決CRISPR基因編輯在乳酸菌中應(yīng)用時(shí)遇到的異源密碼子偏好性和細(xì)胞毒性的問題；在副干酪乳桿菌中，可以通過導(dǎo)入人為設(shè)計(jì)的CRISPR RNA和修復(fù)模板能解決菌株因自身特性或攜帶代表質(zhì)粒較大等原因所導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化效率過低的問題。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)，包括：

CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)，基因編輯為在細(xì)胞中或體外進(jìn)行基因編輯，其特征在于，所述CRISPR/LpCas9基因編輯系統(tǒng)為LpCas9蛋白和sgRNA復(fù)合體，能精確定位靶向DNA序列，并產(chǎn)生切割，使DNA發(fā)生雙鏈斷裂損傷；所述LpCas9蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述sgRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的sgRNA序列。

優(yōu)選的是，所述細(xì)胞包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞；所述真核細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞；所述原核細(xì)胞包括副干酪乳桿菌。

優(yōu)選的是，所述LpCas9蛋白包括無切割活性、具有單鏈切割活性和具有雙鏈切割活性的LpCas9蛋白變體。

優(yōu)選的是，所述LpCas9蛋白是原始LpCas9蛋白的DNA序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化處理再轉(zhuǎn)錄翻譯得到的，檢測細(xì)胞為HEK293T細(xì)胞，原始LpCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，優(yōu)化處理后的LpCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

優(yōu)選的是，所述sgRNA是根據(jù)crRNA和tracrRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果設(shè)計(jì)得到。