[發明專利]CRISPR/LpCas9基因編輯系統及其應用

有效

• 申請號: 202010531552.0
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111748539B
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 逄曉陽;李偉勛;楊蘭;呂加平;蘆晶;張書文;朱青;徐琛
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農產品加工研究所
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113;C12N15/74;C12N15/85;C12N15/90
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理有限公司 11369
• 代理人: 卞靜靜

1.CRISPR/LpCas9基因編輯系統，在細胞中進行基因編輯，其特征在于，所述CRISPR/LpCas9基因編輯系統為LpCas9蛋白和sgRNA復合體，能精確定位靶向DNA序列，并產生切割，使DNA發生雙鏈斷裂損傷；所述LpCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述sgRNA的核苷酸序列為：5’-gtatcctgcttcattaacta-3’。

2.如權利要求1所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統，其特征在于，所述細胞包括真核細胞和原核細胞；所述真核細胞包括哺乳動物和植物細胞。

3.如權利要求1所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統，其特征在于，所述LpCas9蛋白是原始LpCas9蛋白的DNA序列經過密碼子優化處理再轉錄翻譯得到的，檢測細胞為HEK293T細胞，原始LpCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，優化處理后的LpCas9蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.如權利要求1所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統，其特征在于，所述sgRNA是根據crRNA和tracrRNA二級結構預測結果設計得到。

5.如權利要求1所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統，其特征在于，所述精確定位DNA序列側翼包括LpCas9蛋白和sgRNA復合體識別靶向DNA序列上的PAM序列。

6.如權利要求5所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統，其特征在于，所述PAM序列為TCAAAA，所述靶向DNA序列為SEQ ID NO:5所示。

7.如權利要求5所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統，其特征在于，所述PAM序列為TGTAAA，所述靶向DNA序列為SEQ ID NO:5所示。

8.如權利要求1～7中任一所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統的試劑盒，其包括LpCas9蛋白和靶向DNA序列的sgRNA。

9.如權利要求1～7中任一所述的CRISPR/LpCas9基因編輯系統進行基因編輯中編輯效率的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、根據TCAAAA的PAM序列設計靶向目標基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列為：5’-gtatcctgcttcattaacta-3’；

S2、人源密碼子優化后LpCas9基因序列和相應的sgRNA一并克隆到表達載體上,LpCas9基因序列如SEQ ID NO:4所示；

S3、將載體轉化至HEK293T細胞中；

S4、提取細胞基因組，設計引物擴增基因編輯位置的DNA片段；

S5、使用T7E1酶檢測編輯效率。