[發明專利]一種核酸適體功能化NK細胞及其制備與應用

在審

• 申請號: 202010530479.5
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111662871A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 鄭友世;劉小龍;張達;林自國
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學孟超肝膽醫院（福州市傳染病醫院）
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N15/115;A61K47/54;A61K35/17;A61K41/00;A61P35/00;A61K49/00
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明公開了一種用于近紅外引導下免疫/光熱時序協同治療肝癌的核酸適體功能化NK細胞及其制備與應用。本發明通過糖代謝途徑將核酸適體共價偶聯于NK細胞膜表面(G?NK)，賦予其對肝癌的靶向作用；利用G?NK細胞負載近紅外熒光/光熱轉換分子ICG，構建免疫/光學時序性治療載體系統(ICG@G?NK)；以ICG作為分子影像探針，實現近紅外熒光監測G?NK細胞對腫瘤的富集，進而精準獲取腫瘤的位置信息；在實現G?NK細胞介導的免疫治療后，啟動光熱治療(PTT)，進一步殺傷殘存腫瘤細胞；同時PTT可破壞實體瘤的致密組織結構，進一步促進G?NK細胞富集和浸潤，達到免疫/光學時序性協同治療肝癌的目的，這將為NK細胞用于肝癌的綜合治療提供新策略。

(一)技術領域

本發明涉及一種核酸適體功能化NK細胞，及其制備方法以及在制備肝癌過繼性免疫治療藥物中的應用。

(二)背景技術

根據國家癌癥中心發布的《2019中國最新癌癥報告》顯示：我國新增癌癥病例中，肝癌發病人數位列第四，死亡率排名第二，嚴重威脅著我國人民的生命健康及生活質量。盡管目前肝癌治療以手術切除為主，輔以放療、介入治療等綜合治療手段，獲得了一定的治療效果，但預后仍較差，肝癌患者的遠期生存率仍較低。

基于NK細胞的過繼性免疫治療是一種不依賴于抗原預先致敏而直接識別與攻擊腫瘤細胞的免疫細胞治療策略。NK細胞具有良好的殺傷腫瘤細胞特性，通過分泌TNF-α、IFN-γ、顆粒酶及穿孔素等細胞因子誘導腫瘤細胞凋亡或壞死。NK細胞不需要抗原預先致敏就能直接識別和攻擊腫瘤細胞，并且NK細胞具有良好的組織浸潤能力能夠快速浸入腫瘤組織內部，因此受到業界普遍關注。但是NK細胞缺乏腫瘤特異性靶向能力及其體外擴增效率較低，限制其更深入的臨床運用。基因工程/嵌合抗原受體改造的自然殺傷性細胞(CAR-NK細胞)能夠通過其表面表達的scFv片段特異性識別腫瘤細胞，促進NK細胞向腫瘤部位富集，是提高NK細胞靶向能力的有效手段之一。但是，由于實體腫瘤組織間質致密以及免疫抑制微環境導致免疫治療效果有限，以及CAR-NK細胞存在制備工藝復雜、成本昂貴等問題，極大的限制了其臨床推廣應用。

多手段聯合治療是提高肝癌治療療效的重要策略。免疫細胞治療與光熱治療具有天然的聯合和協同治療基礎，將其聯合能夠有效提高實體腫瘤的治療效果。光熱治療(Photo Thermal Therapy，PTT)是利用近紅外光照射，促使光熱轉換物質(如ICG、PDA等物質)將光能轉化為熱能，導致腫瘤細胞受熱壞死的治療手段。它具有無創、選擇性高、無腫瘤耐藥性等優點，能夠在腫瘤免疫抑制微環境下發揮腫瘤治療效果，并打破實體腫瘤致密的組織結構，進而吸引免疫效應細胞進一步浸潤腫瘤組織，實現對殘存腫瘤細胞的免疫殺傷。

當前免疫治療聯合光熱治療的策略主要是通過將光熱轉換物質包裹在各種腫瘤靶向/響應的納米材料中使其靶向富集于腫瘤部位進行光熱治療，再輔助回輸免疫效應細胞，從而形成簡單的聯合治療方式。該聯合治療方式依賴于復雜的具有腫瘤靶向富集、成像、光熱轉換性能的納米材料，兩者之間難以真正有效協同，且存在納米材料的長期安全性、免疫細胞腫瘤部位富集動力學不清楚等諸多問題，距離臨床應用遙遠。

兼具熒光成像功能的免疫/光熱聯合治療更具臨床轉化與應用優勢，首先，熒光成像具有較高的時間和空間分辨率，能夠實時動態、可視化監測免疫細胞在腫瘤部位富集，進而精準為光熱治療提供腫瘤的位置信息；其次，免疫細胞在腫瘤部位富集與光熱轉換物質體內代謝都具有一定的時效性，準確判定最佳光照時機能夠進一步提高免疫/光熱聯合治療效果。

(三)發明內容

為了解決上述技術難題，本發明提供了一種用于近紅外引導下免疫/光熱時序協同治療肝癌的核酸適體功能化NK細胞，及其在在制備肝癌過繼性免疫治療藥物中的應用。

本發明采用的技術方案是：

一種核酸適體功能化NK細胞，由如下方法制備獲得：

(1)制備PBMC細胞，與滋養細胞IL21-K562共培養，獲得體外激活擴增NK細胞；