[發明專利]一種核酸適體功能化NK細胞及其制備與應用

在審

• 申請號: 202010530479.5
• 申請日: 2020-06-11
• 公開（公告）號: CN111662871A
• 公開（公告）日: 2020-09-15
• 發明（設計）人: 鄭友世;劉小龍;張達;林自國
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學孟超肝膽醫院（福州市傳染病醫院）
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N15/115;A61K47/54;A61K35/17;A61K41/00;A61P35/00;A61K49/00
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.一種核酸適體功能化NK細胞，由如下方法制備獲得：

(1)制備PBMC細胞，與滋養細胞IL21-K562共培養，獲得體外激活擴增NK細胞；

(2)步驟(1)獲得的NK細胞經疊氮修飾甘露糖(Ac₄ManNAz)代謝后，在NK細胞膜表面表達疊氮基團，獲得糖代謝工程化的NK細胞；

(3)將DBCO修飾的GPC3核酸適體與糖代謝工程化的NK細胞混合共孵育，獲得所述核酸適體功能化NK細胞；所述DBCO修飾的GPC3核酸適體的核苷酸序列如下：5’-DBCO-TAACGCTGACCTTAGCTGCATGGCTTTACATGTTCCA-3’。

2.制備權利要求1所述的核酸適體功能化NK細胞的方法，所述方法包括：

(1)制備健康PBMC細胞，將其以1:5～10的比例與IL21-K562滋養細胞混合，于NK細胞培養基中培養至第7～8天，調整NK細胞密度0.3～1.5×10⁶個/mL，按照NK細胞：IL21-K562比例1:1～5，補充滋養細胞IL21-K562，每天補充NK細胞培養基至第12～14天，制備獲得體外激活擴增的NK細胞；所述NK細胞培養基組分為：IL-2 100～300IU/mL，慶大霉素50～100U/mL，溶劑為KBM581培養基；

(2)步驟(1)獲得的NK細胞加入疊氮修飾甘露糖培養18～24小時后，加入熒光/光熱轉換物質吲哚菁綠，繼續培養18～24小時，獲得ICG@NK細胞；

(3)將獲得的ICG@NK細胞加入DBCO修飾的GPC3核酸適體在37℃共孵育0.5～1小時，獲得具有熒光及光熱轉換效應的ICG@G-NK細胞，即所述核酸適體功能化NK細胞；所述DBCO修飾的GPC3核酸適體的核苷酸序列如下：5’-DBCO-TAACGCTGACCTTAGCTGCATGGCTTTACATGTTCCA-3’。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中疊氮修飾的甘露糖添加濃度為0.5～8μg/mL。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)DBCO修飾的GPC3核酸適體添加濃度為0.01～1μmol/mL。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述熒光/光熱轉換物質吲哚菁綠添加濃度為0.1～200μg/mL。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述NK細胞培養基組成為：IL-2200IU/mL，慶大霉素80U/mL，溶劑為KBM581培養基。

7.權利要求1所述的核酸適體功能化NK細胞在制備肝癌過繼性免疫治療藥物中的應用。